Nuevos conocimientos sobre la reotaxis, la aglutinación y la formación de haces de esperma en pollos Sharkasi basados ​​en un estudio in vitro

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13003 (2022) Citar este artículo

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La fertilidad de las aves depende de su capacidad para almacenar poblaciones adecuadas de esperma viable durante períodos prolongados en los túbulos de almacenamiento de esperma (SST). Los mecanismos exactos por los cuales los espermatozoides ingresan, residen y egresan de las SST aún son controvertidos. El esperma de pollo Sharkasi mostró una alta tendencia a aglutinarse, formando haces móviles similares a hilos que comprenden muchas células. Dado que es difícil observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides dentro del oviducto opaco, empleamos un dispositivo de microfluidos con una sección transversal de microcanales que se asemeja a la de las glándulas espermáticas, lo que permite el estudio de la aglutinación y el comportamiento de la motilidad de los espermatozoides. Este estudio analiza cómo se forman los paquetes de espermatozoides, cómo se mueven y qué papel pueden tener en la extensión de la residencia de los espermatozoides dentro de las SST. Investigamos la velocidad de los espermatozoides y el comportamiento de la reotaxis cuando se generó un flujo de fluido dentro de un canal de microfluidos por presión hidrostática (velocidad de flujo = 33 µm/s). Los espermatozoides tendían a nadar contra la corriente (reotaxis positiva) y los paquetes de espermatozoides tenían una velocidad significativamente menor en comparación con los espermatozoides solitarios. Se observó que los paquetes de esperma nadaban en un movimiento en espiral y crecían en longitud y grosor a medida que se reclutaban más espermatozoides solitarios. Se observaron haces de esperma acercándose y adhiriéndose a las paredes laterales de los canales de microfluidos para evitar ser barridos con una velocidad de flujo de fluido > 33 µm/s. La microscopía electrónica de barrido y de transmisión reveló que los paquetes de esperma estaban sostenidos por una sustancia copiosa y densa. Los hallazgos muestran la motilidad distinta del esperma de pollo Sharkasi, así como la capacidad del esperma para aglutinarse y formar paquetes móviles, lo que proporciona una mejor comprensión del almacenamiento de esperma a largo plazo en las SST.

Para lograr la fertilización en humanos y en la mayoría de los animales, el esperma y el óvulo deben llegar al sitio de fertilización en el momento correcto. Por lo tanto, la cópula debe tener lugar antes o durante la ovulación. Algunas especies de mamíferos, como perros, y clases de no mamíferos, como insectos, peces, reptiles y aves, por otro lado, almacenan esperma en sus órganos reproductivos durante largos períodos de tiempo hasta que sus óvulos están listos para ser fertilizados (fertilización asíncrona1 ). Las aves son capaces de mantener espermatozoides viables capaces de fertilizar los óvulos por períodos que van de 2 a 10 semanas2.

Esta es una característica única que distingue a las aves de otros animales, ya que permite una alta probabilidad de fertilización después de una sola inseminación durante varias semanas sin necesidad de sincronizar el apareamiento y la ovulación. El principal órgano de almacenamiento de esperma, llamado túbulos de almacenamiento de esperma (SST), se encuentra en los pliegues de la mucosa interna de la unión uterovaginal3. Hasta la fecha, los mecanismos de entrada, residencia y evacuación de los espermatozoides de los reservorios de espermatozoides no se comprenden completamente. Según investigaciones anteriores, se han propuesto una serie de hipótesis al respecto, pero ninguna de ellas ha sido confirmada.

Forman4 propuso que los espermatozoides mantienen su residencia en la luz de las SST mediante un movimiento oscilatorio continuo en contra de la dirección de un fluido que fluye a través de los canales de proteínas ubicados en las células epiteliales de las SST (reotaxis). Debido a la actividad continua de los flagelos necesaria para mantener los espermatozoides dentro de la luz de la SST, el ATP se agota y la motilidad finalmente disminuye hasta que el flujo de líquido transporta a los espermatozoides fuera de los reservorios de espermatozoides para comenzar un nuevo viaje ascendiendo por el oviducto para fertilizar el óvulo (Forman4). Este modelo de almacenamiento de esperma está respaldado por los hallazgos que confirman la presencia de acuaporinas 2, 3 y 9 en el epitelio de SST por inmunocitoquímica5. Hasta la fecha, faltan estudios sobre la reotaxis de los espermatozoides en pollos y el papel que puede desempeñar en el almacenamiento de SST, la selección vaginal de espermatozoides y la competencia entre espermatozoides. En las gallinas, la eyaculación de esperma se deposita en la vagina después del apareamiento natural; sin embargo, más del 80% de los espermatozoides salen de la vagina poco después de la cópula6. Esto sugiere que la vagina es el principal sitio de selección de espermatozoides en las especies aviares. Además, también se ha informado que menos del 1% de los espermatozoides inseminados en la vagina ingresan a las SST2. Cuando los pollos fueron inseminados artificialmente en la vagina, el número de espermatozoides que alcanzaron las SST tendió a aumentar a las 24 h después de la inseminación. Hasta ahora, se desconocía el mecanismo de selección de espermatozoides en este proceso, y la motilidad de los espermatozoides puede desempeñar un papel importante en la captación de espermatozoides en las SST4. Es difícil monitorear la motilidad de los espermatozoides en el oviducto directamente en especies de aves debido a la pared gruesa y opaca del oviducto. Por lo tanto, carecemos de conocimientos básicos sobre cómo se transfieren los espermatozoides a las SST después de la inseminación.

La reotaxis se ha considerado recientemente un factor importante que controla el transporte de esperma en los genitales de los mamíferos7. Con base en la capacidad de los espermatozoides viables para migrar contra un flujo, Zaferani et al.8 utilizaron un sistema de corral de microfluidos para aislar pasivamente los espermatozoides móviles de la muestra de semen dentro de un corral. Esta clasificación de espermatozoides es necesaria para los tratamientos médicos de infertilidad y los estudios clínicos y se prefiere en comparación con los métodos convencionales que requieren mucho tiempo y trabajo y podrían ser perjudiciales para la morfología e integridad de la estructura de los espermatozoides8. Sin embargo, hasta ahora, no ha habido ningún estudio sobre el efecto del flujo en los genitales de los pollos sobre la motilidad de los espermatozoides.

Independientemente del mecanismo que mantiene el esperma almacenado en las SST, varios investigadores han observado que los espermatozoides residentes se aglutinan "cabeza con cabeza" formando haces de esperma aglutinado en las SST de pollos9,10, codornices2 y pavos11. Los autores sugirieron que existe una relación entre esta aglutinación y el período prolongado de almacenamiento de esperma en las SST.

Tingari y Lake12 informaron de la estrecha asociación entre los espermatozoides dentro de las glándulas anfitrionas de esperma de las gallinas y tenían curiosidad por saber si los espermatozoides aviares se aglutinaban de la misma manera que los espermatozoides de mamíferos. Sugirieron que la conexión profunda entre las células de esperma en las glándulas de esperma podría deberse a la presión causada por la existencia de una gran cantidad de espermatozoides en un espacio pequeño.

La evidencia transitoria de aglutinación fue visible cuando se evaluó el comportamiento de los espermatozoides en portaobjetos colgantes frescos, especialmente a lo largo del borde de la gota de semen. Sin embargo, la aglutinación fue frecuentemente interrumpida por la acción de remolino asociada con la motilidad continua, lo que explica la naturaleza fugaz de este fenómeno9. Los investigadores también notaron agregaciones de células alargadas "en forma de hilo" cuando se agregó diluyente al semen.

Uno de los primeros intentos de simular las glándulas espermáticas se llevó a cabo retirando un alambre delicado de un portaobjetos colgante, lo que provocó que una vesícula alargada sobresaliera de la gota de semen, similar a una glándula espermática9. Los espermatozoides se alinearon instantáneamente en un patrón paralelo dentro de la vesícula, pero la unidad general se desvaneció rápidamente debido a las limitaciones tridimensionales. En consecuencia, para estudiar las aglutinaciones de espermatozoides, es necesario observar el movimiento y el comportamiento de los espermatozoides directamente en los túbulos de almacenamiento de espermatozoides aislados y esto es difícil de lograr. Por lo tanto, se requiere diseñar una herramienta que simule la glándula espermática para respaldar los estudios de motilidad y comportamiento de aglutinación de los espermatozoides. Brillard et al.13 informaron que la longitud promedio de los túbulos de almacenamiento de esperma en gallinas adultas es de 400 a 600 µm, pero algunas SST pueden medir 2000 µm. Mero y Ogasawara14 clasificaron las glándulas espermáticas en túbulos de almacenamiento de esperma agrandados y no agrandados, los cuales tenían longitudes similares (alrededor de 500 µm) y anchos de cuello (aproximadamente 38 µm), pero los túbulos de los dos grupos tenían diámetros de luz promedio de 56,6 y 11,2 micras, respectivamente. En el estudio actual, utilizamos un dispositivo de microfluidos con dimensiones de canal de 200 μm × 20 μm (ancho × alto) para brindar una sección transversal algo cercana a la de las SST agrandadas. Además, estudiamos la motilidad de los espermatozoides y el comportamiento de aglutinación en un fluido que fluye para estar en línea con la hipótesis de Forman de que las células epiteliales de las SST producen fluido que mantiene los espermatozoides en la luz nadando contra la dirección del flujo (reotaxis).

Los objetivos del estudio fueron superar los problemas de observar la motilidad de los espermatozoides dentro del oviducto y evitar las dificultades de estudiar la reotaxis y el comportamiento de los espermatozoides en un entorno dinámico. Se utilizó un dispositivo de microfluidos que generó presión hidrostática para modelar la motilidad de los espermatozoides dentro de los genitales de los pollos.

Cuando se cargó una gota de muestra de semen diluido (1:40) dentro del dispositivo de microcanales, se reconocieron dos tipos de motilidad de los espermatozoides (solitario y en paquetes). Además, los espermatozoides mostraron una tendencia a nadar contra la corriente (reotaxis positiva; Videos 1, 2). Aunque los paquetes de espermatozoides tenían una velocidad más baja que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Se estimó que el porcentaje de reotaxis positiva era de aproximadamente el 53 % y el 85 % para los espermatozoides solitarios y los paquetes, respectivamente.

Se observó que los espermatozoides de los pollos Sharkasi formaban paquetes similares a hilos que constaban de muchas decenas de individuos inmediatamente después de la eyaculación. Estos paquetes aumentan en longitud y grosor con el tiempo y pueden permanecer in vitro durante horas antes de dispersarse (Video 3). Estos haces filiformes tienen una forma similar a los de los espermatozoides de equidna formados en el segmento terminal del epidídimo. Se encontró que el esperma de pollo Sharkasi tiene una alta tendencia a aglutinarse y formar una red de paquetes menos de un minuto después de la recolección. Estos paquetes son móviles y pueden adherirse a cualquier pared adyacente u objeto estático. Aunque los paquetes de espermatozoides reducen la velocidad de los espermatozoides, era obvio que aumentaban macroscópicamente su linealidad. Los paquetes varían en longitud según el número de espermatozoides ensamblados en el paquete. Se reconocen dos segmentos del paquete: la parte inicial, que comprende las cabezas libres de los espermatozoides aglutinados, y la parte terminal, que incluye las colas y los espermatozoides distales completos. Mediante una cámara de alta velocidad (950 cuadros/s), observamos que las cabezas libres de los espermatozoides aglutinados, en la parte inicial del haz, son las responsables de la motilidad del haz debido a sus movimientos oscilatorios, que arrastran al resto de los espermatozoides. haz en un movimiento en espiral (Video 4). Sin embargo, en paquetes largos, se observó que algunas cabezas libres de espermatozoides adheridos en el cuerpo y la parte terminal del paquete actúan como paletas y ayudan en el movimiento del paquete.

Los paquetes de esperma se movieron paralelos entre sí cuando estaban presentes en un flujo de fluido lento; sin embargo, comienzan a superponerse y adherirse a cualquier objeto estacionario para no ser arrastrados por la corriente que fluye cuando aumenta la velocidad del flujo. La formación del paquete comienza con pocos espermatozoides acercándose unos a otros, y comienzan a moverse sincrónicamente y se envuelven entre sí y luego se adhieren a la sustancia adhesiva. Las figuras 1 y 2 muestran a los espermatozoides acercándose entre sí formando un punto de conexión debido a que las colas se enroscan entre sí.

Los investigadores aplicaron presión hidrostática para crear un flujo de fluido dentro del microcanal donde se estudió la reotaxis de los espermatozoides. Se emplearon microcanales con dimensiones de 200 μm × 20 μm (ancho × alto) y una longitud de 3,6 μm. Se utilizaron los microcanales entre depósitos con jeringas montadas en los extremos. Para hacer el canal más visible, se emplearon colorantes alimentarios.

Paquete de interconexiones y accesorios a las paredes. Video tomado del microscopio de contraste de fase. Imágenes de microscopía de contraste de fase y dibujos acompañan a cada imagen para su presentación. (A) La conexión entre dos hilos por movimiento en espiral para resistir el flujo (flecha roja). (B) Fijación entre los haces y la pared del canal (flecha roja); al mismo tiempo, están conectados a otros dos paquetes (flecha amarilla). (C) Los paquetes de esperma dentro del canal de microfluidos comienzan a conectarse (flechas rojas) entre sí, formando una red de paquetes de esperma. (D) La formación de una red de haces de esperma.

Cuando se cargó una gota de semen diluido en el dispositivo de microfluidos y se generó un flujo, se notó que los paquetes de esperma se movían en contra de la dirección del flujo. Los haces se acercan a las paredes de los microcanales, y las cabezas libres en la parte inicial del haz se adhieren fuertemente a ellos (Video 5). También se adhieren a cualquier partícula estacionaria, como escombros, en su camino como un intento de resistir la deriva con la corriente. Con el tiempo, estos paquetes son hilos largos que atrapan otros espermatozoides individuales y paquetes más cortos (Video 6). Cuando el flujo comenzó a ser más lento, los largos hilos de esperma comenzaron a formar una red de hilos de esperma (Video 7; Fig. 2).

A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos en espiral de los hilos se incrementan como un intento de atrapar muchos espermatozoides individuales formando paquetes que resisten mejor la fuerza de deriva del flujo. También intentan unirse a la pared lateral del microcanal.

Los paquetes de espermatozoides se identificaron mediante microscopía óptica (LM) como una acumulación de cabezas de espermatozoides y colas enrolladas. También se identificaron haces de esperma de diferentes agregaciones, como cabezas retorcidas y agregados de flagelos, como colas adheridas de múltiples espermatozoides, con la cabeza del espermatozoide unida a la cola, con la cabeza del espermatozoide con un núcleo doblado, como múltiples colas de espermatozoides adheridas, y como cabezas de espermatozoides adheridas entre sí por una sustancia de aglutinación utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). La microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés) reveló un paquete de espermatozoides como un agregado de cabezas de espermatozoides cubiertas por una capa, con los agregados de espermatozoides mostrando una red de colas envueltas unidas.

La morfología y la ultraestructura de los espermatozoides, así como la formación de haces, se investigaron utilizando un microscopio óptico (sección semidelgada), microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), y los frotis de semen se tiñeron con naranja de acridina y se examinó mediante microscopía de epifluorescencia.

Las cabezas de los espermatozoides se adhirieron entre sí y se cubrieron con material secretor, como lo muestra la tinción con naranja de acridina de los frotis de esperma (Fig. 3B) y esto resultó en la formación de grandes paquetes (Fig. 3D). Los paquetes de espermatozoides consistían en agregaciones de espermatozoides que exhibían una red de colas adheridas (Fig. 4A-C). El paquete de esperma consistía en colas envueltas adheridas de múltiples espermatozoides (Fig. 4D). Una secreción (Fig. 4E,F) cubre las cabezas de esperma del paquete.

Formación de haces de esperma utilizando un microscopio de contraste de fase y un frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra que la cabeza del espermatozoide se mantiene unida. (A) La formación temprana de paquetes de esperma comenzó con esperma (círculo blanco) y tres espermatozoides (círculo amarillo), y la espiral comenzó en la cola y finalmente en la cabeza. (B) Micrografía de un frotis de semen teñido con naranja de acridina que muestra que la cabeza del espermatozoide se pega (flechas). La secreción cubre las cabezas (S). Ampliación ×1000. (C) El desarrollo de grandes paquetes transportados a través del flujo en el canal de microfluido (usando una cámara de alta velocidad a 950 cuadros/s). (D) Micrografía de frotis de esperma teñida con naranja de acridina que muestra la formación de grandes haces (flechas). Ampliación: ×200.

Imágenes de micrografía electrónica de barrido de haces de esperma y un frotis de esperma teñido con naranja de acridina. (A, B, D, E) son micrografías electrónicas de barrido coloreadas digitalmente de espermatozoides, mientras que C y F son micrografías de frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina y que muestran una red de colas envueltas adherentes de múltiples espermatozoides. (A–C) Agregaciones de espermatozoides que se muestran como una red de colas adheridas (puntas de flecha). (D) Múltiples espermatozoides de colas envueltas adheridas (con la sustancia aglutinante, delineada en rosa, flechas). (E y F) Agregados de cabezas espermáticas (flechas) recubiertas por un material aglutinante (puntas de flecha). Los espermatozoides formaron haces con pocas estructuras en forma de espiral (F). Ampliación de (C) ×400 y (F) ×200.

Usando microscopía electrónica de transmisión, mostramos que los paquetes de esperma tenían colas adheridas (Fig. 6A, C), con las cabezas adheridas a la cola (Fig. 6B), o las cabezas unidas a las colas (Fig. 6D). La cabeza del espermatozoide en el paquete estaba doblada, presentando dos secciones del núcleo en la sección cortada (Fig. 6D). En el paquete de la sección cortada, los espermatozoides tenían cabezas retorcidas con dos secciones del núcleo y múltiples porciones del flagelo (Fig. 5A).

Micrografías electrónicas de transmisión coloreadas digitalmente que muestran colas conectadas en un haz de espermatozoides y material de aglutinación que conecta las cabezas de los espermatozoides. (A) Colas de esperma adheridas de numerosos espermatozoides. Nota de cómo aparece la cola en vistas longitudinales (flechas) y transversales (puntas de flecha). (B) La cabeza del espermatozoide (punta de flecha) está unida a la cola (flecha). (C) Varias colas de esperma unidas (puntas de flecha). (D) El material de aglutinación (AS, color azul) conecta cuatro cabezas de esperma (color violeta).

Se usó microscopía electrónica de barrido para detectar las cabezas de esperma en el paquete cubierto por una secreción o capa (Fig. 6B), lo que reveló que los paquetes de esperma estaban retenidos por sustancias extracelulares. La sustancia aglutinante se concentró en las cabezas de los espermatozoides (ensamblaje similar a una cabeza de medusa; Fig. 5B) y se extendió distalmente, con una apariencia amarilla brillante bajo un microscopio de fluorescencia cuando se tiñó con naranja de acridina (Fig. 6C). Esta sustancia es claramente visible al microscopio de barrido y se considera la materia aglutinante. Las secciones semifinas (Fig. 5C) y los frotis de semen teñidos con naranja de acridina revelaron que el paquete de espermatozoides contenía cabezas apretadas y colas enrolladas (Fig. 5D).

Varias micrografías que muestran la cabeza del espermatozoide y la agregación de la cola envuelta utilizando varios métodos. (A) Micrografía electrónica de transmisión coloreada digitalmente de un haz de espermatozoides en una sección cortada que muestra cabezas de espermatozoides torcidas que tienen dos porciones del núcleo (color azul) y varias porciones del flagelo (color verde). (B) Micrografía electrónica de barrido coloreada digitalmente que muestra un grupo de cabezas de espermatozoides similares a medusas que parecían estar recubiertas (flechas). (C) Secciones semifinas que muestran agregación de cabezas de espermatozoides (flechas) y colas envueltas (puntas de flecha). (D) Micrografía de frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina que muestra agregados de cabezas de espermatozoides (flechas) y colas adherentes envueltas (puntas de flecha). Tenga en cuenta que la sustancia adhesiva (S) cubrió la cabeza del espermatozoide. Ampliación de (D) ×1000.

Usando un microscopio electrónico de transmisión (Fig. 7A), también se observó que la cabeza del espermatozoide estaba torcida y que el núcleo se asemejaba a una forma helicoidal, que estaba sostenido por frotis de semen teñidos con naranja de acridina y estudiados con un microscopio de fluorescencia (Fig. 7B ).

(A) Micrografía electrónica de transmisión digital a color y (B) frotis de semen teñido con naranja de acridina que muestra cabezas torcidas y unión de cabezas y colas de espermatozoides (flecha). Ampliación de (B) ×1000.

El hallazgo de que los espermatozoides de Sharkasi se aglutinan, formando haces móviles similares a hilos, es interesante. Las propiedades de estos paquetes brindan información sobre el papel que pueden desempeñar en la captación y el almacenamiento de espermatozoides en las SST.

Después del apareamiento, los espermatozoides se depositan en la vagina y se someten a un intenso proceso de selección que da como resultado que solo una cantidad limitada de espermatozoides ingresen a las SST15,16. Hasta la fecha se desconoce el mecanismo por el cual los espermatozoides ingresan y evacuan las SST. En las aves domésticas, los espermatozoides se mantienen dentro de las SST durante períodos prolongados que van de 2 a 10 semanas, según la especie6. La controversia permanece con respecto al estado de los espermatozoides durante el almacenamiento dentro de las SST; ¿Están en estado de movimiento o inactividad? En otras palabras, ¿cómo mantienen los espermatozoides su posición dentro de las SST durante períodos prolongados?

Forman4 propuso que la residencia y la salida de los espermatozoides de la SST pueden explicarse sobre la base de la motilidad de los espermatozoides. El autor sugirió que los espermatozoides mantienen su posición nadando contra una corriente de fluido generada por las células epiteliales de la SST y que los espermatozoides salen de la SST cuando su velocidad cae por debajo de un punto en el que comienza el movimiento de retirada debido a la falta de energía. Zaniboni5 confirmó la presencia de las acuaporinas 2, 3 y 9 dentro de la porción apical de las células epiteliales de las SST, lo que puede respaldar indirectamente el modelo de almacenamiento de esperma de Forman. En el estudio actual, encontramos que casi la mitad de los espermatozoides de Sharkasi muestran reotaxis positiva en presencia de un fluido que fluye y que los paquetes de espermatozoides aglutinados aumentan la cantidad de espermatozoides que exhiben reotaxis positiva, aunque la aglutinación ralentiza su velocidad. No se comprende completamente cómo ascienden los espermatozoides al oviducto en las aves para llegar al sitio de fertilización. En los mamíferos, el líquido folicular quimioatrae a los espermatozoides7. Sin embargo, se cree que los quimioatrayentes guían a los espermatozoides a una distancia de aproximación7. Por lo tanto, otros mecanismos son los responsables del transporte de los espermatozoides. Se informó que la capacidad de los espermatozoides para orientarse y nadar contra el flujo del fluido oviductal secretado después de la cópula es un factor importante responsable de la orientación de los espermatozoides en ratones7. Parker17 asumió que los espermatozoides atraviesan el oviducto nadando contra la corriente ciliar en aves y reptiles. Aunque no se probó experimentalmente in vivo para aves, Adolphi18 fue el primero en observar que los espermatozoides aviares exhiben reotaxis positiva cuando se genera una corriente lenta en una capa delgada de líquido contenido entre un cubreobjetos y un portaobjetos de vidrio utilizando una tira de papel de filtro. Hino y Yanagimachi19 instalaron un complejo de ovarios-oviducto-útero de ratón en un collar de perfusión e inyectaron 1 µl de tinta china en el istmo para visualizar el flujo de fluido dentro del oviducto. Notaron un movimiento muy activo de contracción y relajación en el oviducto en el que todos los bolos de tinta se movían constantemente hacia la ampolla del oviducto. Los autores destacaron la importancia del flujo de fluido del oviducto desde la parte inferior a la superior del oviducto para la ascensión y fertilización de los espermatozoides. En pollos y pavos, Brillard20 reportó que la migración de los espermatozoides, desde la entrada a la vagina donde se depositan hasta la unión uterovaginal donde se almacenan, se logra a través de su motilidad activa. Sin embargo, esta motilidad no es necesaria entre la unión uterovaginal y el infundíbulo porque los espermatozoides son transportados por desplazamiento pasivo. Con el conocimiento de estas sugerencias anteriores y los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede suponer que la capacidad de los espermatozoides para moverse contra la corriente (reotaxis) es uno de los atributos sobre la base de los cuales se lleva a cabo el proceso de selección. Y esto determina el paso de los espermatozoides por la vagina y su llegada a las SST para su almacenamiento. También puede contribuir al proceso de penetración de los espermatozoides en las SST y su residencia durante un cierto período y luego su salida cuando su velocidad comienza a disminuir, como planteó la hipótesis de Forman4.

Por otro lado, Matsuzaki y Sasanami21 sugirieron que los espermatozoides aviares experimentan cambios de motilidad de inactivos a móviles tanto en el tracto reproductivo masculino como femenino. Se propuso la supresión de la motilidad de los espermatozoides residentes dentro de las SST para explicar el almacenamiento prolongado de espermatozoides, que es seguido por la restauración de la motilidad después de la liberación de las SST21. En condiciones hipóxicas, Matsuzaki et al.1 informaron una producción y liberación elevadas de ácido láctico en las SST, lo que puede conducir a la supresión de la motilidad de los espermatozoides residentes. En este caso, la importancia de la reotaxis de los espermatozoides se manifiesta durante la selección y captación de espermatozoides, pero no durante el almacenamiento.

Se sugirió que el modo de aglutinación de espermatozoides era una aclaración plausible para el período prolongado de almacenamiento de espermatozoides dentro de las SST porque este es el patrón de residencia de espermatozoides común entre las aves domésticas2,22,23. Bakst et al.2 observaron que la mayoría de los espermatozoides se adhieren entre sí, formando aglutinaciones en forma de paquetes, y rara vez se ven espermatozoides solitarios en las SST de las codornices. Por otro lado, Wen et al.24 observaron más espermatozoides dispersos y menos paquetes de espermatozoides en la luz de las SST en pollos. A partir de estas observaciones, se puede suponer que la tendencia de los espermatozoides a aglutinarse difiere entre las especies de aves y entre los espermatozoides en el mismo eyaculado. Además, Van Krey et al.9 sugirieron que la disociación aleatoria de los espermatozoides aglutinados es responsable de la salida gradual de los espermatozoides hacia la luz del oviducto. De acuerdo con esta suposición, los espermatozoides con menor capacidad de aglutinación deberían salir primero de las SST. En este caso, la capacidad de aglutinación de los espermatozoides podría ser un factor que influya en los resultados de la competencia espermática en aves promiscuas. Además, cuanto más tiempo tarden los espermatozoides aglutinados en disociarse, mayor será la duración de la fertilidad.

Si bien las agregaciones de espermatozoides y su adhesión en haces se han observado en varios estudios2,22,24, aún no se han descrito en detalle debido a la dificultad de observarlos cinemáticamente dentro de las SST. Se han realizado pocos intentos para estudiar las aglutinaciones de esperma in vitro. Se observaron agregaciones extensas pero transitorias cuando se retiró un alambre delicado a través de una gota colgante de semen. Esto provocó que una vesícula alargada se proyectara desde la gota, simulando una glándula de esperma. Debido a las limitaciones tridimensionales y al poco tiempo que tarda la gota en secarse, todo el conjunto se deterioró rápidamente9. En el estudio actual que utilizó pollos Sharkasi y un chip de microfluidos, pudimos describir cómo se forman estos paquetes y cómo se mueven en detalle. Los paquetes de esperma se forman tan pronto como se recolecta el semen y se encontró que nadan en un movimiento en espiral y muestran una reotaxis positiva cuando están presentes en un flujo. Además, se observó que los paquetes de espermatozoides aumentan la linealidad de la motilidad en comparación con los espermatozoides solitarios cuando se observan macroscópicamente. Esto indica que la aglutinación de espermatozoides puede ocurrir antes de la penetración de SST y que su formación no está sujeta a estar confinada en un área pequeña debido a la presión como se sugirió anteriormente (Tingari y Lake12). Durante la formación del haz de espermatozoides, los espermatozoides nadan sincrónicamente hasta que forman sitios de conexión, luego sus colas se envuelven entre sí y las cabezas de los espermatozoides permanecen libres, pero las colas y los espermatozoides distales se adhieren entre sí mediante una sustancia adhesiva. Por tanto, las cabezas libres del haz son las responsables del movimiento arrastrando al resto del haz. La microscopía electrónica de barrido de los paquetes de esperma reveló cabezas de esperma adheridas cubiertas con una sustancia adhesiva abundante, lo que indica que las cabezas de esperma se unen en paquetes estacionarios que pueden ocurrir después de llegar al sitio de almacenamiento (SST).

Cuando los frotis de semen se tiñen con naranja de acridina, la sustancia adhesiva extracelular que rodea a los espermatozoides es visible bajo un microscopio de fluorescencia. Esta sustancia permite que los paquetes de esperma se adhieran a cualquier superficie o partículas circundantes y se adhieran a ellas para que no se desplacen con las corrientes circundantes. Por lo tanto, nuestras observaciones arrojan luz sobre el papel que juega la adhesión de los espermatozoides en forma de haces móviles. Su capacidad para nadar contra la corriente, así como su capacidad para adherirse a las superficies adyacentes, mantienen la residencia de los espermatozoides durante un tiempo prolongado dentro de las SST.

Rothschild25 usó una cámara de hemocitómetro para examinar la distribución de natación de los espermatozoides de toro en una gota de suspensión tomando micrografías a través de la cámara cuando el eje óptico del microscopio era vertical y horizontal. Los resultados mostraron que los espermatozoides son atraídos por las superficies de la cámara. Los autores sugirieron que podría haber interacciones hidrodinámicas entre el esperma y las superficies. Teniendo esto en cuenta, así como la capacidad de los espermatozoides de pollo Sharkasi para formar paquetes pegajosos, puede aumentar la posibilidad de que los espermatozoides se adhieran a las paredes de la SST y se almacenen durante un tiempo prolongado.

Baccetti y Afzeliu26 informaron que el glucocáliz de los espermatozoides es esencial para el reconocimiento y la aglutinación de los gametos. Forman10 observó que la hidrólisis de los enlaces α-glucosídicos en el revestimiento de glicoproteína-glucolípido mediante el tratamiento de espermatozoides de aves con neuraminidasa resultó en una disminución de la fertilidad sin afectar la vitalidad de los espermatozoides. Los autores especularon que la manipulación del glucocáliz por la neuraminidasa perturbó el secuestro de esperma en la unión útero-vaginal, lo que en consecuencia disminuyó la fertilidad. Sus observaciones no pudieron descartar la posibilidad de que el tratamiento con neuraminidasa pudiera haber reducido el reconocimiento de ovocitos espermáticos. Forman y Engel10 encontraron que las tasas de fertilidad disminuían cuando las gallinas eran inseminadas intravaginalmente con espermatozoides tratados con neuraminidasa. Sin embargo, la inseminación intramagnética con espermatozoides tratados con neuraminidasa no tuvo efecto sobre la fertilidad en comparación con las aves de control. Los autores concluyeron que las alteraciones en la cubierta de glicoproteína-glucolípido que rodea la membrana espermática reducen la capacidad de fertilización de los espermatozoides al perturbar el secuestro de espermatozoides en la unión útero-vaginal, lo que a su vez aumenta la velocidad a la que se pierden espermatozoides en la unión útero-vaginal, pero no no afecta el reconocimiento de espermatozoides-ovocitos.

En pavos, Bakst y Bauchan11 encontraron pequeñas vesículas y fragmentos de membrana en el lumen de las SST y observaron que algunas de estas partículas estaban fusionadas con la membrana del esperma. Los autores especularon que estas interconexiones podrían contribuir al almacenamiento prolongado de esperma en las SST. Sin embargo, los investigadores no aclararon la fuente de estas partículas, si son secretadas por las células epiteliales de las SST, producidas y secretadas por el sistema reproductivo masculino o por los propios espermatozoides. También, si estas partículas son las responsables de la aglutinación. Grützner et al.27 informaron que las células epiteliales del epidídimo producen y secretan una(s) proteína(s) específica(s) que se necesita(n) para la formación de paquetes de espermatozoides en monotremas. Los autores también informaron que la dispersión de estos paquetes depende de las interacciones de las proteínas del epidídimo. Nixon et al.28 encontraron que la proteína secretada por el epidídimo, la osteonectina ácida rica en cisteína; SPARC participa en la formación de haces de esperma tanto en el equidna de pico corto como en el ornitorrinco. Estando asociada la dispersión de estos haces con la pérdida de esta proteína.

En el estudio actual, el análisis de ultraestructura mediante microscopía electrónica reveló que los espermatozoides se adhirieron a grandes cantidades de sustancias densas. Se cree que estas sustancias son responsables de la aglutinación, y se condensan entre y alrededor de las cabezas adheridas, pero se encuentran en menor concentración en la región de la cola. Sugerimos que esta sustancia aglutinante es secretada por el sistema reproductor masculino (epidídimo o conducto deferente) con el semen porque frecuentemente observamos que los espermatozoides son secuestrados del líquido linfático y del plasma seminal en el momento de la eyaculación. Se informó que cuando los espermatozoides de las aves pasan a través del epidídimo y los conductos deferentes, experimentan cambios de maduración que respaldan su capacidad para unir proteínas y adquirir glicoproteínas asociadas a la lemma plasmática29,30. Estas proteínas persisten en las membranas de los espermatozoides residentes en las SST, lo que sugiere que estas proteínas pueden influir en la adquisición de la estabilidad de la membrana espermática30 y determinar su capacidad fertilizante31. Ahammad et al.32 informaron que los espermatozoides obtenidos de diferentes partes del sistema reproductivo masculino (desde los testículos hasta el conducto deferente distal) mostraron tasas de supervivencia gradualmente crecientes en condiciones de almacenamiento líquido, independientemente de la temperatura de almacenamiento, y también aumentaron la capacidad de sobrevivir en la gallina. oviducto después de la inseminación artificial.

Los paquetes de esperma de pollo Sharkasi tienen características y funciones diferentes en comparación con los descubiertos en otras especies, como el equidna, el ornitorrinco, el ratón de madera, el ratón ciervo y el conejillo de Indias. En los pollos Sharkasi, la formación de paquetes de espermatozoides disminuye su velocidad de natación en comparación con los espermatozoides individuales. Sin embargo, estos paquetes aumentan el porcentaje de espermatozoides que muestran reotaxis positiva y mejoran la capacidad de los espermatozoides para estabilizarse en un entorno dinámico. Por lo tanto, nuestros hallazgos refuerzan las sugerencias anteriores de que la aglutinación de espermatozoides en las SST está asociada con una duración prolongada del almacenamiento de espermatozoides. También especulamos que la tendencia de los espermatozoides a formar paquetes puede controlar la tasa de pérdida de espermatozoides de las SST, lo que, como resultado, puede cambiar los resultados de la competencia de espermatozoides. De acuerdo con esta especulación, los espermatozoides con baja capacidad de aglutinación evacuan primero las SST, mientras que los machos que poseen espermatozoides con alta capacidad de aglutinación generan la mayor parte de la progenie. La formación de haces de espermatozoides en monotremas es ventajosa y afecta las proporciones de paternidad pero utilizando un mecanismo diferente. En el equidna y el ornitorrinco, los espermatozoides se disponen paralelos entre sí para aumentar la velocidad de avance del paquete28. La motilidad del haz en el equidna es aproximadamente tres veces más rápida que la del espermatozoide solitario27. La formación de tales paquetes de esperma en equidna se considera una adaptación evolutiva para afirmar el dominio porque las hembras son promiscuas y comúnmente se aparean con varios machos. En consecuencia, los espermatozoides de diferentes eyaculados están en alta competencia para fertilizar los óvulos33.

Los paquetes de espermatozoides aglutinados en pollos Sharkasi se observan fácilmente con un microscopio de contraste de fase, lo que se considera ventajoso porque permite estudiar fácilmente el comportamiento de los espermatozoides in vitro. El mecanismo por el cual la formación de paquetes de espermatozoides beneficia la reproducción en los pollos Sharkasi también difiere del observado en algunos mamíferos euterios que representan un comportamiento cooperativo de los espermatozoides, como los ratones de madera, donde algunos espermatozoides muestran un comportamiento altruista al ayudar a otros individuos relacionados a alcanzar el óvulo y comprometer su vida. propia capacidad fertilizante34. Otro ejemplo de comportamiento cooperativo de los espermatozoides se descubre en ratones ciervos, donde los espermatozoides pueden reconocer y agregarse a los espermatozoides más relacionados genéticamente y formar grupos cooperativos para aumentar su velocidad contra los espermatozoides no relacionados35.

Los resultados obtenidos en este estudio no contradicen la teoría de Foman para explicar el almacenamiento a largo plazo de los espermatozoides dentro de las SST. El investigador informó que los espermatozoides pasan largos períodos de tiempo en constante movimiento contra una corriente de células epiteliales que recubren las SST y que, después de un tiempo, la reserva de energía de los espermatozoides se agota y, como resultado, la velocidad disminuye, lo que permite el drenaje de energía de baja energía. espermatozoides con el líquido que fluye desde la luz de las SST hacia la luz del oviducto. Observamos en el estudio actual que la mitad de los espermatozoides solitarios muestran la capacidad de nadar contra el fluido que fluye y que su adhesión en paquetes aumenta su capacidad para mostrar reotaxis positiva. Además, nuestros hallazgos no contradicen los de Matsuzaki et al.1, quienes informaron un aumento de la secreción de ácido láctico en las SST que puede suprimir la motilidad de los espermatozoides residentes. Sin embargo, nuestros resultados describen la formación de haces de espermatozoides móviles y su comportamiento reotáctico cuando están presentes en un entorno dinámico dentro de microcanales como un intento de dilucidar su comportamiento en las SST. La investigación futura probablemente se centre en identificar la composición química y la fuente del material aglutinante, lo que sin duda ayudará a los investigadores a idear nuevos métodos para almacenar esperma líquido y aumentar la duración de la fertilidad.

Quince gallos Sharkasi de cuello desnudo (homocigotos dominantes; Na Na) de treinta semanas de edad fueron seleccionados y utilizados como donantes de esperma en el estudio. Las aves se criaron en la Granja Avícola de Investigación, Facultad de Agricultura, Universidad de Assiut, Gobernación de Assiut, Egipto. Las aves se alojaron en jaulas individuales (30 × 40 × 40 cm), se expusieron a un programa de iluminación (16 h luz: 8 h oscuridad) y se alimentaron con una dieta comercial que contenía 160 g de proteína cruda, 2800 kcal de energía metabolizable, 35 g de calcio, y 5 g de fósforo disponible por kg de dieta.

Para la colecta de semen de gallos se utilizó el método de masaje abdominal según36,37. En total, se recolectaron 45 muestras de semen durante un período de 3 días de los 15 machos. Los eyaculados (n = 15/día) se diluyeron inmediatamente con diluyente de semen de aves de corral Beltsville 1:1 (v:v) que comprendía difosfato de potasio (1,27 g), glutamato de sodio monohidrato (0,867 g), fructosa (0,5 g), acetato de sodio anhidro ( 0,43 g), tris (hidroximetil)-aminometano (0,195 g), citrato de potasio monohidrato (0,064 g), monofosfato de potasio (0,065 g), cloruro de magnesio (0,034 g) y H2O (100 ml); pH = 7,5 y osmolalidad 333 mOsm/kg38. Las muestras de semen diluido se examinaron inicialmente con un microscopio óptico para garantizar la buena calidad del esperma (motilidad vigorosa) y luego se mantuvieron en un baño de agua a 37 °C hasta su uso dentro de la media hora posterior a la recolección.

La cinemática y la reotaxis de los espermatozoides se describieron utilizando el sistema de dispositivos de microfluidos. Las muestras de semen se diluyeron aún más a 1:40 en diluyente de semen de aves de corral de Beltsville y se cargaron en el dispositivo de microfluidos (ver a continuación), y los parámetros cinéticos se determinaron a través de un sistema de análisis de esperma asistido por computadora (CASA)39 que se desarrolló previamente para la caracterización del movimiento de los espermatozoides en entornos microfluídicos (Departamento de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ingeniería, Universidad de Assiut, Egipto). El complemento se puede descargar desde la URL: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Se midieron la velocidad curvilínea (VCL, µm/s), la velocidad en línea recta (VSL, µm/s) y la velocidad de trayectoria promedio (VAP, µm/s). Los videos de los espermatozoides se tomaron con un microscopio invertido Optika XDS-3 con contraste de fase (a objetivos de 40x) acoplado a una cámara Tucson ISH1000 a 30 cuadros/s durante 3 s. Se examinaron un mínimo de tres campos y 500 rastros de esperma por muestra utilizando el software CASA. Los videos grabados se procesaron utilizando un CASA desarrollado en casa. La definición de motilidad en el complemento CASA se basa en la velocidad de natación de los espermatozoides frente a la velocidad de flujo sin incluir otros parámetros, como el movimiento de lado a lado, ya que se encontró que esto es más confiable en el flujo de fluidos. El movimiento reotáctico se describió como la natación de los espermatozoides en contra de la dirección del flujo del fluido. Los espermatozoides que presentaban reotaxis se dividieron por el número de espermatozoides móviles; con espermatozoides estáticos y los barridos por el flujo convectivo, se eliminaron del conteo.

Todos los productos químicos utilizados se obtuvieron de Elgomhoria Pharmaceuticals (El Cairo, Egipto), a menos que se especifique lo contrario. El dispositivo se fabricó según lo descrito por El-sherry et al.40, con algunas modificaciones. Los materiales para la fabricación de microcanales incluyeron obleas de vidrio (Howard Glass, Worcester, MA), resistencia negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol de diacetona (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) y polidimetilsiloxano PDMS (Syllgard-184, Dow Corning, Midland, MI). Los microcanales se fabricaron mediante litografía blanda41. Primero, se imprimió una máscara de transparencia con el diseño de microcanal requerido utilizando una impresora de alta resolución (Prismatic, Cairo, Egypt y Pacific Arts and Design, Markham, ON). Los maestros se prepararon utilizando obleas de vidrio como sustrato. Las obleas se limpiaron en acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada y luego se recubrieron con una capa de SU8-25 de 20 µm de espesor mediante recubrimiento por rotación (3000 rpm, 1 min). Luego, la capa SU-8 se horneó suavemente (65 °C, 2 min y 95 °C, 10 min) y se expuso a la luz ultravioleta durante 50 s. Se realizó un horneado posterior a la exposición a 65 °C durante 1 min y 95 °C durante 4 min para reticular la capa expuesta de SU-8, que luego se reveló en alcohol de diacetona durante 6,5 min. Las obleas se endurecieron (200 °C durante 15 min) para endurecer aún más la capa SU-8.

El PDMS se preparó mezclando el monómero y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso y luego se desgasificó en un desecador al vacío y se vertió en el maestro SU-8. El PDMS se curó en un horno (120 °C, 30 min) y luego se cortaron los canales, se despegó el maestro y se perforaron para permitir las conexiones de los tubos en la entrada y salida de los microcanales. Finalmente, se usó un tratador de corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL) para unir permanentemente los microcanales de PDMS a un portaobjetos de vidrio de microscopio como se describe en otro lugar42. Las dimensiones de los microcanales utilizados en el presente estudio fueron 200 μm × 20 μm (ancho × alto) y 3,6 cm de largo.

El flujo de líquido inducido por la presión hidrostática dentro del microcanal se logró manteniendo el nivel de líquido en el depósito de entrada más alto que en el depósito de salida con una diferencia de altura Δh39 (Fig. 1).

La velocidad promedio dentro del microcanal se puede calcular usando la ecuación de Darcy-Weisbach,

donde f es el factor de fricción definido como f = C/Re para flujo laminar en un conducto rectangular, donde C es una constante que depende de la relación de aspecto del canal, L es la longitud del microcanal, Vav es la velocidad promedio dentro del microcanal, Dh es la diámetro hidráulico del canal, y g es la aceleración gravitacional. Usando esta ecuación, la velocidad promedio dentro del canal se puede calcular usando la siguiente ecuación:

Se forma un perfil de velocidad a lo largo de un canal y se calculó utilizando la siguiente ecuación para canales con una relación de aspecto inferior a 0,5.

donde V es la velocidad del líquido en cualquier lugar del canal, Vav es la velocidad promedio del líquido, a es el ancho del canal, b es la altura del canal, y y z son las dos coordenadas medidas desde la línea central del canal a lo largo de la altura y el ancho del canal respectivamente, y m y n son dos factores numéricos calculados según

La generación de flujo hidrostático es un método simple y de bajo costo para generar flujo dentro de microcanales y no sufre el flujo pulsante típico de las bombas de jeringa43. La velocidad promedio dentro del microcanal se puede calcular utilizando la ecuación de Darcy-Weisbach44. El perfil de velocidad dentro del canal se calculó para canales con una relación de aspecto inferior a 0,545. La velocidad promedio del líquido se mantuvo en 33 ± 5 µm/s.

Después de la recolección y dilución del semen, las muestras (n = 6) se conservaron en fijador Karnovsky46 (Tabla 1) y se prepararon dos alícuotas para cada muestra para el análisis de microscopía electrónica de barrido y la fabricación de resina de secciones semifinas y ultrafinas. Se utilizaron otros tubos que contenían muestras no fijadas para preparar frotis para teñir con naranja de acridina. Los frotis de semen se tiñeron con naranja de acridina, un tinte catiónico que tiñe las vesículas membranosas que contienen proteínas, como las vesículas secretoras, los compartimentos ácidos unidos a la membrana y los lisosomas ácidos. El naranja de acridina sufre una reacción metacromática que está relacionada con la liberación de fluorescencia verde y roja. El naranja de acridina reacciona con las vesículas unidas a la membrana y hace que se tiñan de naranja o rojo. El naranja de acridina se utiliza para detectar vesículas secretoras y lisosomas47,48,49,50.

Componentes de la tinción Agua destilada, naranja de acridina, ácido acético glacial.

Preparación del reactivo Se preparó una solución madre de 50 mg de naranja de acridina en 10 ml de agua destilada y se almacenó en el refrigerador. Para hacer una solución de trabajo, se combinó con 1 mL de solución madre de naranja de acridina y 0,5 mL de ácido acético glacial en 50 mL de agua destilada.

Método de tinción Un frotis se hace en un portaobjetos limpio y luego se seca al aire. Después de eso, el portaobjetos se fijó con metanol y se secó al aire nuevamente. Luego se coloca en un recipiente que contiene una solución de trabajo de tinción con naranja de acridina (es decir, 0,01 por ciento) durante 20 minutos. Los portaobjetos se lavaron y secaron cuidadosamente antes de analizarlos con un microscopio (modelo Letiz DM 2500) con unidades fluorescentes externas (Leica EL 6000).

Después se fijaron dos gotas de semen diluido en fijador de Karnovsky durante 2 h a 4 °C y luego se procesaron según las indicaciones de51. Fijación se aplicó un volumen equivalente de fijador de Karnovsky al semen diluido durante 2 h a 4 °C.

Las muestras fijadas se centrifugaron y el sedimento se suspendió en tampón PBS fresco. Lavado tres veces con solución tampón de fosfato pH 7-2-7-4 (Tabla 1) y centrifugado después de cada lavado

Durante dos horas a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron y se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 10% preparado en tampón de fosfato 0-1 M pH 7-2-7-4 y cloruro de calcio 2-5 mM.

Las muestras se centrifugaron y luego el sedimento se suspendió y se lavó en alcohol etílico al 50%. Después de una centrifugación final, el sedimento se mezcló a fondo en un pequeño volumen de alcohol al 50 %, se recogió en una pipeta Pasteur y se dispensó lentamente gota a gota sobre la superficie de una pila de papeles de filtro rápidos (Whatman 41).

Entre gotitas, el líquido fue absorbido por el papel filtro. Como resultado, se formó una "pila" de material celular en la superficie del papel de filtro, que se pudo quitar con una espátula fina y depositar en una placa de agar al 2-4%. A 60 °C, el material se cubrió con agar fundido.

Después de eliminar el agar adicional que rodeaba la muestra, el "bloque" de material se trató de la manera indicada por52,53 de la siguiente manera: se deshidrató usando grados ascendentes de alcoholes de etanol (70%, 90%, 100I%, 100II%) y incrustado en Epon-araldite. Los bloques se deshidrataron utilizando una mezcla de etanol y óxido de propileno. Los bloques se deshidrataron en grados crecientes de etanol durante 30 min, 70 min durante la noche, 90 min, 100 % I durante 30 min y 100 % II durante 60 min.

La incrustación de resina se llevó a cabo utilizando óxido de propileno (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 30 min, Epon:óxido de propileno (proporción de aproximadamente 1:1) durante 30 min y Epon durante 3 h. Epon se generó combinando 5 ml de Epon 812 (Polysciences, Eppelheim, Alemania) con 5 ml de Araldite y 12 ml de DDSA.

Se utilizó Epon para implantar los bloques, que luego se incubaron a 60 °C. Se utilizó una mezcla de Epon y un acelerador (DMP-30) para polimerizar las muestras (1,5%). Los bloques se incubaron durante 3 días a las siguientes temperaturas: 60 °C el día uno, 70 °C el día dos y 75 °C el día tres.

Se utilizó azul de toluidina para teñir secciones semifinas (1 micra) cortadas con un ultramicrótomo Ultra cut E (Reichert Leica) (tetraborato de sodio [bórax] 1 g, azul de toluidina 1 g y agua destilada 100 ml)54. Las secciones teñidas se examinaron con un microscopio Leitz Dialux 100. Las fotografías fueron tomadas con una cámara digital Canon (Canon Power shot A95).

Elegimos porciones con haces de esperma de secciones semifinas para hacer secciones ultrafinas. Se utilizó un Ultrotom® V para cortar porciones ultrafinas (LKB Bromma, Munich, Alemania). Las secciones de 70 nm se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo55 y se estudiaron con un microscopio electrónico de transmisión JEOL100CX II en la Unidad de Microscopía Electrónica de la Universidad de Assiut en Assiut, Egipto.

El desarrollo de los haces de esperma se observó utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). La preparación de la muestra se llevó a cabo de acuerdo con56 de la siguiente manera: Cada muestra se fijó en fijador de Karnovsky (Tabla 2)46 durante 4 h a 4 °C. A continuación, las muestras se centrifugaron y lavaron en el mismo tampón de fijación (5 veces) antes de posfijarlas durante 2 ha temperatura ambiente en ácido ósmico al 1 % en tampón de fosfato de Na 0,1 M. Se enjuagaron 15 veces con tampón Fosfato 0,1 M. Se utilizaron grados ascendentes de alcohol etanol con concentraciones de 50, 70, 90 y 100 por ciento para secar las muestras (30 min en cada concentración). Cada muestra se distribuyó en un bote de papel de aluminio, se sujetó y luego se secó al aire. Finalmente, las muestras se recubrieron con oro usando un dispositivo de pulverización iónica JEOL1100 E y se examinaron a KV10 usando un microscopio electrónico de barrido JEOL (JSM5400 LV).

Para detectar la estructura precisa, coloreamos digitalmente las imágenes microscópicas electrónicas de barrido y transmisión en Photoshop. Muchos autores ya han empleado esta metodología55,56,57,58,59,60,61,62.

Todos los datos se expresaron como la media ± SD. Se usó Kruskal-Wallis ANOVA en rangos para comparar valores medios, seguido de comparaciones múltiples de Dunn. Todas las estadísticas se calcularon con la ayuda de JMP v5.0.1 (SAS campus drive, Cary, NC, EE. UU.) o el software GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Las diferencias de P < 0,05 se consideraron significativas.

Utilizamos Kruskal-Wallis ANOVA para comparar los espermatozoides solitarios y los movimientos del paquete, que tenían varios tamaños de muestra. Este método se utiliza para comparar dos o más muestras independientes de tamaños de muestra iguales o diferentes.

Todos los datos creados o analizados durante esta investigación se incluyen en este artículo publicado y están disponibles a pedido de los autores.

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El profesor Dr. Jeff Downing, profesor asociado adjunto de la Universidad de Sydney, Australia, fue responsable de la edición exhaustiva en inglés, que mejoró significativamente el trabajo, y los autores desean agradecerle.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por The Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) en cooperación con The Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Estos autores contribuyeron por igual: Taymour M. El-Sherry, Hanan H. Abd-Elhafeez y MAM Sayed.

Departamento de Teriogenología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Assiut, Assiut, 71526, Egipto

Taylor M. El Sherry

Departamento de Células y Tejidos, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Assiut, Assiut, 71526, Egipto

Hanan H. Abd Elhafeez

Departamento de Producción Avícola, Facultad de Agricultura, Universidad de Assiut, Assiut, 71526, Egipto

MAM dijo

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El trabajo se dividió a partes iguales entre los autores. TME, MAMS, HHA, incluido el estudio de investigación, el análisis y la interpretación de datos, la disposición de imágenes y la redacción de documentos. Todos los autores han leído y aprobado la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Hanan H. Abd-Elhafeez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

El-Sherry, TM, Abd-Elhafeez, HH y Sayed, MAM Nuevos conocimientos sobre la reotaxis, aglutinación y formación de paquetes de esperma en pollos Sharkasi basados ​​en un estudio in vitro. Informe científico 12, 13003 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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Recibido: 23 de octubre de 2021

Aceptado: 20 de julio de 2022

Publicado: 29 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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