Diseño de un nuevo chip microfluídico integrado para la separación continua de células tumorales circulantes de células de sangre periférica

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 17016 (2022) Citar este artículo

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El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. La presentación tardía, el diagnóstico y el tratamiento inaccesibles son desafíos comunes en los países desarrollados. Según los informes, la detección y el recuento de células tumorales circulantes (CTC) lo antes posible pueden conducir a un tratamiento más eficaz. El aislamiento de CTC en una etapa temprana es un desafío debido a la baja probabilidad de su presencia en sangre periférica. En este estudio, proponemos un nuevo dispositivo de separación de CTC continuo, rápido y sin etiquetas de dos etapas basado en el enfoque inercial hidrodinámico y la separación dielectroforética. El predominio y el diferencial de la fuerza de elevación inercial inducida por la pared y la fuerza de arrastre de Dean dentro de un canal de microfluidos curvo da como resultado la separación basada en el tamaño de los glóbulos rojos (RBC) y las plaquetas (tamaño entre 2 y 4 µm) de CTC y leucocitos (9– 12,2 micras). Se utilizó un modelo numérico para investigar el mecanismo de enfoque inercial hidrodinámico en un microcanal curvilíneo. Se realizaron simulaciones con glóbulos rojos, plaquetas, CTC y leucocitos (cuatro subtipos principales) para seleccionar el valor optimizado de los parámetros en el diseño propuesto. En la primera etapa, se estudió el comportamiento de enfoque de las células a microescala para clasificar los leucocitos y las CTC de los glóbulos rojos y las plaquetas, mientras que las CTC viables se separaron de los leucocitos en función de sus propiedades eléctricas inherentes mediante dielectroforesis en la segunda etapa. El diseño propuesto del dispositivo se evaluó en cuanto a la eficiencia de separación de CTC mediante simulaciones numéricas. Este estudio consideró la influencia de factores críticos como la relación de aspecto, la fuerza dielectroforética, el tamaño del canal, el caudal, la eficiencia de separación y la forma en la separación celular. Los resultados muestran que el dispositivo propuesto produce CTC viable con una eficiencia de aislamiento del 99,5 % con un rendimiento de 12,2 ml/h.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Observatorio Mundial del Cáncer, se espera que la cantidad de nuevos casos de cáncer por año aumente a 29,5 millones y la cantidad de muertes relacionadas con el cáncer a 16,4 millones para 20401,2. La mayoría de las veces el cáncer no se diagnostica ni se trata hasta que las células tumorales han hecho metástasis en todo el cuerpo3. Posteriormente, el paciente recae en breve con una tasa de supervivencia muy pequeña. Las Células Tumorales Circulantes (CTC) son las células que se desprenden de tumores primarios, recurrencias o metástasis, y circulan en la sangre periférica, y poseen características antigénicas y genéticas específicas del tumor4. Las CTC pueden dar lugar al crecimiento secundario de tumores en otros sitios del cuerpo llamados metástasis4. Los CTC tienen características morfológicas y moleculares distintas; comienzan a aparecer en la sangre completa en una etapa muy temprana del desarrollo del tumor5. Se ha encontrado que el diagnóstico de la enfermedad, el seguimiento y la terapia personalizada del cáncer se pueden realizar manteniendo una cuenta de CTC6. Teniendo en cuenta el hecho, es esencial detectar y evaluar las CTC raras (un marcador no invasivo) para diagnosticar la enfermedad lo suficientemente temprano para un tratamiento efectivo7. La enumeración de CTC de sangre total es muy difícil debido a su escasez en pacientes en estadios tempranos de cáncer, es decir, 1–10 células/ml8 en comparación con otras células 5 × 109/ml de glóbulos rojos, 2 × 108/ml de plaquetas y 1 × 106 leucocitos9. Se requieren CTC viables para un análisis posterior del genotipo y el fenotipo para determinar la progresión del cáncer. La morfología heterogénea de las células cancerosas dificulta técnicamente su aislamiento10. Se necesita un dispositivo de clasificación de células con alta sensibilidad para caracterizar y aislar CTC viables. La detección de CTC a partir de sangre completa, a menudo denominada "biopsia líquida", ha ganado la atención de la comunidad científica y clínica11, porque este método tiene potencial para el diagnóstico, el pronóstico y la evaluación de la eficacia del tratamiento12. Hasta la fecha, se han ideado varios métodos para la detección y aislamiento de CTC13,14,15,16,17,18,19,20. Las técnicas de aislamiento aprovechan las propiedades biofísicas de las CTC que las distinguen de la sangre completa. Los clasificadores de células microfluídicas se utilizan más comúnmente con fines de diagnóstico. La tecnología de microfluidos se utiliza para investigar los procesos de transporte de fluidos en microcanales. Sus ventajas incluyen tamaño de muestra pequeño, tiempo de reacción corto y bajo costo. Se han desarrollado dispositivos lab-on-chip (LOC) con funciones integradas basados en la misma tecnología para realizar análisis biológicos21,22,23. Los clasificadores de células microfluídicas se clasifican en términos generales como activos o pasivos. Las técnicas activas utilizan estimulación externa como eléctrica, magnética, óptica, acústica, bioquímica, etc.22. En las técnicas pasivas no se aplica ninguna fuerza externa, sino que utilizan propiedades intrínsecas como el tamaño, la forma, la arquitectura del canal y las fuerzas hidrodinámicas23. Algunas técnicas requieren el etiquetado de los CTC antes de la separación24,25. Las muestras se etiquetan con ciertos marcadores de superficie celular, por ejemplo, etiquetado fluorescente, tinción previa, unión, etc., para permitir la enumeración y visualización después de la separación. Los investigadores se han centrado en el desarrollo de métodos de enumeración y detección de CTC, incluido el sistema CellSearch. Se han realizado importantes esfuerzos utilizando técnicas de inmunomarcaje específicas para células epiteliales, por ejemplo, EpCAM o varias citoqueratinas. Sin embargo, tienen el riesgo de perder las CTC que no expresan EpCAM o han sufrido una transición epitelial a mesenquimatosa (EMT)4,26,27.

Los métodos de separación por inercia pasiva ofrecen una separación sin etiquetas de alto rendimiento con diseños simples y robustos28, lo que los hace más prometedores. En la microfluídica inercial, los cambios geométricos, por ejemplo, las geometrías curvilíneas y la matriz de contracción-expansión (CEA), inducen un flujo Dean secundario transversal en los microcanales para separar las células en función de sus atributos físicos. Esta separación hidrodinámica utiliza una filtración masiva y de alto rendimiento de células sanguíneas y puede adaptarse a un caudal muy alto. A pesar de la popularidad de los métodos pasivos, estos tienen ciertas limitaciones, por ejemplo, la contaminación de leucocitos en las CTC debido a la superposición del tamaño celular en caso de separación basada en el tamaño29; el diseño generalmente se basa en una muestra debido a las diferentes geometrías para diferentes celdas objetivo30. Los métodos activos, en particular la dielectroforesis (DEP), utilizan un campo eléctrico externo variable y la conductividad eléctrica intrínseca de las células para separar los CTC. DEP es una técnica activa que separa las células en función de su tamaño y propiedades eléctricas. La fuerza DEP se refiere a la fuerza ejercida sobre el momento dipolar inducido de una partícula dieléctrica y/o conductora por un campo eléctrico no uniforme31,32,33. Las células sanguíneas periféricas normales y las CTC de todos los tipos de cáncer y tumores sólidos muestran diferencias dieléctricas constantes cuando se exponen a campos eléctricos variables17,19,34,35, por lo tanto, DEP puede aislar con precisión las CTC de una gama más amplia de células. Este aislamiento no requiere ningún protocolo de marcado de la superficie celular. Dado que las CTC aisladas no están modificadas o son viables, se pueden usar para la caracterización molecular para determinar la progresión del cáncer, lo que generalmente ayuda a desarrollar una terapia personalizada más efectiva. Aprovechando la diferencia en las propiedades eléctricas entre CTC y otras células sanguíneas, se han utilizado ciertos clasificadores basados en DEP en la detección de células tumorales de diferentes tipos, como carcinomas colorrectales, de mama, de próstata y de pulmón. La mayoría de las técnicas basadas en DEP utilizaron muestras binarias enriquecidas y no sangre total36,37,38,39. La preparación de muestras para estos dispositivos es bastante engorrosa y complicada, mientras que, por otro lado, la manipulación de sangre completa también es bastante desafiante. Aunque la técnica DEP muestra un aislamiento CTC preciso, existen ciertas limitaciones, como el bajo rendimiento40 y la reducción de la eficiencia de separación para microfluidos DEP basados en chips debido a la alta conductividad de la sangre41. Además, DEP da como resultado un calentamiento dentro del dispositivo que conduce a un cambio en las propiedades eléctricas de la celda y al daño celular42.

Teniendo en cuenta las limitaciones individuales y las ventajas de las técnicas activas y pasivas, se propusieron dispositivos microfluídicos híbridos. La introducción de múltiples fuerzas mediante la combinación de métodos activos y/o pasivos produjo una alta pureza, una alta sensibilidad de las células separadas y una mayor gama operativa de dispositivos, superando las limitaciones de ambas técnicas22. En la literatura abierta disponible, muchos investigadores combinaron DEP con muchos métodos activos y/o pasivos para mejorar la eficiencia del aislamiento de CTC. DEP también se ha utilizado junto con otras técnicas activas, por ejemplo, magnetoforética, acustoforética, optoforética. Al principio, DEP se combinó con el fraccionamiento de flujo de campo (FFF) en el que el equilibrio celular se logra utilizando fuerzas hidrodinámicas y DEP. Las células se separan en función de sus densidades y se midieron las propiedades dieléctricas y las propiedades físicas dinámicas de las células tumorales43.

En un estudio anterior realizado por Moon y sus colegas, DEP se combinó con la técnica de fraccionamiento de flujo de múltiples orificios (MOFF) para separar las células de cáncer de mama MCF-7 de los glóbulos rojos y los glóbulos blancos a una velocidad de flujo alta de 126 µl/min39,44. La muestra se preparó utilizando WBC y RBC obtenidos mediante centrifugación de sangre completa y CTC enriquecidos. La eficiencia de separación de CTC en el estudio informado fue del 75,18 % debido a la pérdida de CTC en la separación en serie y la contaminación de glóbulos rojos. Presentaban una configuración bastante larga (alrededor de 10 cm).

Apostream, un dispositivo que combina DEP con un método de fraccionamiento de flujo de campo pasivo (FFF), utilizó células mononucleares de sangre periférica (PBMN) aisladas de 7,5 ml de sangre humana normal y células tumorales enriquecidas con cáncer de ovario SKOV3 y células de cáncer de mama MDA-MB-231 en él. La recuperación promedio informada de células tumorales de este dispositivo fue de 75,4 % ± 3,1 % y 71,2 % ± 1,6 %11. Aunque se mejoró la separación, el dispositivo informado tenía ciertos problemas, como un rendimiento limitado y una sobrecarga de celdas que provocaba interacciones dipolo-dipolo, agrupamiento y mezcla de celdas.

El DEP-FFF tiene un rendimiento limitado debido al procesamiento por lotes. Un grupo de investigación introdujo una plataforma microfluídica de flujo continuo de 160 mm de largo y 25 mm de ancho. La muestra se preparó usando células de cáncer de mama MDA-MB-231 premarcadas enriquecidas con PBMN. Tiene una eficiencia de separación promedio del 75 % y es capaz de procesar muestras de 10 ml en menos de una hora45. Sin embargo, la gran configuración plantea la cuestión de si se podría lograr el mismo propósito en una disposición más corta. Otro grupo de investigación presentó la plataforma acoplada inercial DEP para la separación de partículas. Utilizaron partículas de poliestireno de diferentes tamaños en un canal serpenteante con DEP negativo vertical (n-DEP). La fuerza DEP hizo levitar las partículas y su enfoque se puede hacer verticalmente alterando el caudal y el voltaje en tiempo real sin necesidad de rediseñar. Informaron una eficiencia de separación del 100 % y del 96 % para partículas de 13 µm y 5 µm respectivamente46,47. Se informó un sistema integrado de separación de células usando hidroforesis junto con DEP48. En la hidroforesis, las microestructuras inducen gradientes de presión hidrodinámica para manipular las partículas en suspensión. El módulo de hidroforesis se basó en un canal serpenteante con microestructuras y se aplicó DEP utilizando una matriz de electrodos inclinados. El sistema se probó para separar las células sesgadas de astrocitos de las células madre neurales de ratón con una velocidad de flujo de 3,5 ul/min49. Se ha encontrado que la interacción célula-célula se vuelve significativa cuando el hematocrito de la sangre excede el 1%50. La sobrecarga puede resolverse diluyendo la muestra de sangre, pero solo hasta 1:10, ya que más allá de esta proporción, el pH de la sangre cambia provocando que las células sanguíneas cambien sus características biológicas (membrana celular)51.

La conductividad eléctrica de la sangre y su nivel de hemoglobina tiene una relación directa52. Si la hemoglobina se separa de la sangre total, se reducirá la sobrecarga celular y el calentamiento por julios. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que si los glóbulos rojos, que contienen hemoglobina, se separaran de la sangre total, se reduciría la conductividad, la sobrecarga celular y el calentamiento por julios durante la separación DEP de la muestra restante. La separación temprana de los glóbulos rojos y las plaquetas de la muestra evitará el problema de la interacción célula-célula, ya que el nivel de hematocrito disminuirá. Esto también podría reducir el tiempo de procesamiento del aislamiento de CTC. Además, una exposición más prolongada al campo eléctrico también causa estrés en las células que puede reducirse mediante el enriquecimiento previo de CTC y WBC de otras células sanguíneas como glóbulos rojos y plaquetas. Esto se puede hacer agregando una etapa de preprocesamiento al clasificador DEP en una sola plataforma. Las técnicas existentes utilizan una plataforma de centrifugación para el enriquecimiento previo antes de la clasificación por DEP. Sin embargo, estudios previos reportaron pérdida celular debido a la citotoxicidad causada por el hilado53. Además, el retraso en la centrifugación da como resultado la mezcla de sangre con medio de gradiente. La centrifugación a alta velocidad estresa las células activando y alterando así la expresión de proteínas y genes de los leucocitos54. De manera similar, la clasificación magnética de la muestra de sangre para eliminar los glóbulos rojos modula la expresión de proteínas de superficie de muchos cánceres, especialmente los que se originan en los tejidos epiteliales, lo que dificulta el aislamiento debido a los antígenos de superficie cambiantes55,56. En la microfluídica inercial, los parámetros que controlan el flujo secundario son el número de Reynolds Re, el número de Dean K y la relación de aspecto del canal AR57. Por lo tanto, se pueden desarrollar varios dispositivos de eficiencia y rendimiento deseados mediante la manipulación de estos parámetros. En general, se acepta que un instrumento debe completar un análisis de CTC para un procedimiento clínicamente relevante para una muestra en dos horas58,59. Presumimos que con una combinación de estas geometrías y manipulando el flujo de Dean, la configuración podría ser más corta y el proceso de separación se llevaría a cabo en un tiempo comparativamente menor. Debido a la escasez de CTC y las complicaciones en el manejo de muestras de sangre periférica, la mayoría de los investigadores utilizan muestras binarias o enriquecidas para probar los dispositivos propuestos. Tal práctica podría no ser válida cuando se compara con los resultados de la muestra de sangre total.

En este artículo de investigación, todos los problemas mencionados anteriormente, incluida la sobrecarga celular, la interacción célula-célula, el calentamiento por julios, la modulación de las expresiones de proteínas de superficie, la pérdida celular y el tiempo de procesamiento se han abordado utilizando otro mecanismo de separación integrado con DEP en un entorno microfluídico. Proponemos aquí un novedoso dispositivo de microfluidos integrado en serie de dos etapas para separar los glóbulos rojos y las plaquetas de la sangre total mediante el enfoque inercial y luego las CTC se aislarán de los leucocitos mediante DEP. El método híbrido propuesto toma sangre periférica como entrada. El dispositivo ha sido diseñado para reducir la sobrecarga de la celda, aumentar el rendimiento y la pureza, ya que combina las ventajas de más de un método. La adición de otra etapa elimina el riesgo de pérdida de muestra y ha mejorado la eficiencia de aislamiento en comparación con los métodos existentes. Este estudio tiene como objetivo diseñar un dispositivo microfluídico para la detección de células tumorales de glioblastoma (GBM). Las células GBM habitan la región normal del cerebro a través de la difusión y la falla en la detección resulta en incurabilidad quirúrgica y el paciente fallece dentro de los 14,2 meses60. En la literatura abierta, no se ha discutido un dispositivo DEP híbrido de este tipo para el aislamiento de células GBM.

El resto de este documento está organizado de la siguiente manera: la Sección II explica el concepto y el diseño del dispositivo propuesto, los detalles de modelado y simulación se proporcionan en la Sección III. Los principales resultados, la discusión relacionada y la optimización de los parámetros de diseño se presentan en la Sección IV. Las conclusiones se encuentran en el apartado V.

El diseño propuesto consiste en un canal de enfoque inercial curvilíneo combinado integrado en serie (etapa pasiva) y un canal de clasificación DEP (etapa activa). La primera etapa tiene dos entradas, una para la inyección de la muestra y la otra para el flujo de enfoque, es decir, la solución tampón. La muestra y el tampón inyectados siguen la geometría combinada diseñada hasta la región de bifurcación, desde donde las CTC y los leucocitos separados se envían a la segunda etapa, mientras que los glóbulos rojos y las plaquetas se acumulan en la salida de desechos. La entrada de la segunda etapa está configurada simétricamente con la salida de la primera etapa para mantener las condiciones de campo de flujo continuo. La segunda etapa aísla selectivamente las células hGBM a través de DEP. La segunda etapa comprende dos entradas, un juego de electrodos y dos salidas. La primera entrada de esta etapa se conecta a la salida de la primera etapa de modo que las celdas separadas se conviertan en la entrada de la segunda etapa. Otra entrada es para la inyección de un tampón. Una salida es para la recolección de CTC y la otra es para WBC (salida de desechos). La Figura 1 presenta el dispositivo de microfluidos con una etapa pasiva integrada y una etapa activa.

La representación esquemática en 3D del dispositivo desarrollado con ambas etapas integradas. Una vez que la muestra de sangre se introduce a través de la entrada, la mayoría de las células sanguíneas, incluidos los glóbulos rojos, las plaquetas, los linfocitos T y los linfocitos B, se separan en la etapa de enfoque inercial y la segunda etapa. Finalmente, las raras células tumorales circulantes se separan selectivamente usando DEP y se recolectan a través de la salida II. Los glóbulos blancos residuales salen por la salida de residuos-III.

Cuando el fluido entra en la región rectangular de contracción curva, las partículas experimentan fuerzas de sustentación inercial y fuerzas de arrastre de Dean. La dirección y magnitud de la migración de partículas depende del tamaño de la partícula y del equilibrio entre estas fuerzas. Dado que el ancho del canal es mayor que la altura, se induce una alta velocidad de corte entre las partes superior e inferior de las paredes laterales. Esto da como resultado el movimiento de partículas hacia la parte superior e inferior del canal debido a las fuertes fuerzas de sustentación de inercia. Por lo tanto, al cambiar la relación de aspecto del canal, se puede lograr una separación inercial basada en el tamaño debido al cambio de la tasa de corte y, por lo tanto, a la fuerza de sustentación inercial.

Los flujos de enfoque inercial están gobernados por tres fuerzas principales: una fuerza inducida por la pared, una fuerza de sustentación de gradiente de corte y una fuerza de arrastre de flujo secundario. Una celda que fluye a través de un microcanal interactuará con sus paredes, lo que hace que (a) se mueva más lentamente que el fluido y (b) cree una presión entre la celda y la pared que desarrolla una fuerza dirigida en dirección opuesta a la pared del canal. Esta fuerza es inversamente proporcional a la distancia entre la partícula y la pared del canal. La ecuación. 1 describe la fuerza de sustentación inducida por la pared61 como:

donde v es la relación entre la densidad del fluido ρ y la viscosidad del fluido µ, r es el radio de la partícula, D es la distancia entre las paredes del canal, s es la distancia no dimensional desde la partícula hasta la pared de referencia, d/D de modo que 0 < s < 1 para partículas en el canal, D1 y D2 son funciones de la distancia a la pared no dimensionalizada s, n es la pared normal en el punto más cercano en la pared de referencia, I es la matriz identidad y v es la velocidad del fluido.

Como el perfil típico de velocidad microfluídica es parabólico, una celda estará expuesta a velocidades de diferentes magnitudes simultáneamente, lo que hace que el fluido induzca una fuerza sobre la celda en la dirección del aumento de la cizalla, es decir, la pared del canal. Esta fuerza se presenta en la Ec. 2.

donde C es constante, \(D_{h} = \frac{2wh}{{w + h}}\) es el diámetro hidráulico (w es el ancho de la región de expansión y h es la altura del canal microfluídico), vm es el Velocidad máxima del canal. Esta ecuación muestra que esta fuerza depende del número de Reynolds de los canales y la posición de las partículas, pero es independiente de la rotación de las partículas. Esta fuerza de sustentación de gradiente cortante utilizada en la simulación es proporcionada por62. Suponiendo que el número de Reynolds de partículas < 1 y el flujo parabólico, la magnitud total de estas fuerzas de sustentación es proporcionada por Evgeny63

donde \(G\) es la tasa de corte local y \(f_{L}\) se define como el coeficiente de sustentación. Esta función depende de la posición de la partícula en el canal y del número de Reynolds del canal. En cuanto a los flujos secundarios, se utilizan para controlar el número de posiciones de equilibrio dentro de una sección transversal de canal determinada. La ecuación 4 muestra la fuerza de arrastre aplicada por estos flujos secundarios. Asumiendo la resistencia de Stokes, está dada por64.

donde R es el radio de curvatura del canal curvo. Esta fuerza de arrastre es directamente proporcional a la velocidad del flujo secundario y al tamaño de la celda. Sin embargo, está inversamente relacionado con el radio de curvatura de la región curva del canal y el número de Reynolds del canal.

El diseño propuesto utiliza curvas y CEA y, por lo tanto, las fuerzas varían a medida que cambia la geometría. El equilibrio entre estas dos fuerzas determina las posiciones finales de equilibrio de las partículas. Las partículas tienden a ubicarse entre la pared del canal y el centro bajo el efecto de la sustentación inercial. La ecuación 3 muestra que la fuerza escala linealmente con el radio de la celda. Esto hace que las partículas grandes se muevan hacia la pared del canal. Una vez allí, estas celdas no se ven afectadas por la fuerza de arrastre decano y mantienen una distancia desde el centro vertical del canal. Las celdas más pequeñas no se ven afectadas por la fuerza de sustentación inercial y, por lo tanto, se mueven hacia el centro bajo el efecto del flujo limpio dirigido radialmente. Así, las células se separan según su tamaño a la salida del canal.

La relación entre las fuerzas acumulativas de sustentación y arrastre \(\frac{{F_{L} }}{{F_{D} }}\) es el factor determinante de dónde se equilibra una celda de un diámetro dado en el canal identificando lo que la fuerza domina. Cuando la relación es > > 1, ocurre el enfoque inercial de las micropartículas, mientras que cuando se vuelve < < 1, la fuerza de arrastre limpia mezcla las partículas65,66. La ecuación 3 muestra que la intensidad de la migración inercial depende de los parámetros del sistema y que es directamente proporcional a dos veces el tamaño de la celda. Por lo tanto, las celdas con diámetros grandes tienden a moverse hacia la pared del canal y logran una posición de equilibrio en algún lugar entre la pared y el centro. El enfoque de la célula/partícula por la fuerza de sustentación inercial dominante depende en gran medida de la relación ap/Dh, donde ap es el diámetro de la célula64,67. En esta relación, el diámetro hidráulico es un factor importante debido al cambio en la altura del canal en la misma condición del número de Reynolds. De acuerdo con nuestro enfoque e hipótesis propuestos, la separación eficiente previa de glóbulos rojos y plaquetas (tamaño ~ 2-4 µm) de la sangre completa podría facilitar el aislamiento y la recuperación de CTC en la etapa DEP. A partir de los hallazgos de Lee et al.68, un microcanal CEA con una relación de aspecto baja permite la separación de partículas de menos de 4 µm de diámetro con un alto caudal y rendimiento. Por lo tanto, optamos por una relación de aspecto baja de la región de contracción del canal microfluídico inercial. Teniendo en cuenta los diámetros de todas las células diana, inicialmente diseñamos diferentes canales de microfluidos Curved-CEA con una relación de aspecto baja (AR = H/W) y una altura de canal que oscila entre 40 y 100 µ. Estudiamos el comportamiento del enfoque celular explorando cuantitativamente el efecto de la modulación de la fuerza de inercia. La relación ap/Dh de los CTC con una relación de aspecto de 0,8–2 se calculó con 0,17–0,07, respectivamente.

Después de separarse del resto de las células sanguíneas, las CTC con células sanguíneas residuales (principalmente monocitos y granulocitos) pasan a la segunda etapa en la que se aplica una técnica activa para aislar con precisión las CTC de los leucocitos. La fuerza DEP se refiere a la fuerza ejercida sobre el momento dipolar inducido de una partícula dieléctrica y/o conductora por un campo eléctrico no uniforme69. La fuerza actúa solo si existe el diferencial entre la permitividad de la partícula y la del fluido circundante. La intensidad de la fuerza dielectroforética sobre las partículas depende del gradiente de permitividad entre la suspensión y las partículas. Si una celda biológica homogénea esférica de radio rp se coloca en un campo eléctrico variable mientras flota en un medio, la fuerza dielectroforética total, despreciando el orden superior de polarización, se puede estimar como 70

donde ε0 = 8.854187817 × 10−12 F/m es la permitividad del vacío, Re(CM) es la parte real del factor de Clausius-Mossotti que describe la variación de frecuencia de la polarizabilidad efectiva de la partícula en el medio44,69. Depende de las permitividades complejas de las celdas, el medio de suspensión y la frecuencia del campo eléctrico aplicado externamente70,71. Dado que es una función de la frecuencia del campo eléctrico, juega un papel importante en el proceso de separación. Las células biológicas no son homogéneas debido a la membrana celular de bicapa lipídica y las estructuras y fluidos intracelulares, por lo tanto, para calcular el factor CM, consideramos un modelo de capa única presentado por70 asumiendo una célula como una partícula con una capa externa delgada (capa) o membrana celular. . Se supone que el volumen dentro de las capas delgadas o las estructuras intracelulares y el fluido tienen conductividad y permitividad uniformes, pero las propiedades de la membrana celular pueden diferir significativamente de las del resto de la célula. En el modelo de capa única, mientras se calcula DEP, se aplica la permitividad relativa compleja equivalente de una partícula homogénea que comprende tanto la membrana celular como el citoplasma de la célula en lugar de la permitividad compleja de la partícula. Si la permitividad compleja de las células se vuelve mayor que la del fluido en suspensión \(\varepsilon_{p}^{*} > \varepsilon_{f}^{*}\), se denomina DEP positivo y atrae a las células hacia el electrodos Por el contrario, el DEP negativo repele las células o partículas de la región de un campo eléctrico alto.

En este estudio, la repulsión DEP negativa se usa en combinación con el enfoque hidrodinámico. El mecanismo de separación en el caso de la separación de DEP es encontrar una frecuencia de CA, donde los CTC experimentan nDEP, mientras que los otros leucocitos restantes experimentan DEP positivo o no DEP (frecuencia de cruce). La fuerza DEP que actúa sobre las celdas es proporcional a su volumen de celda. La fuerza total \(F_{T} = { }F_{DEP} - f\nu ,\) que actúa sobre las celdas viene dada por la fuerza dielectroforética, opuesta a la fuerza de arrastre hidrodinámica. Donde f es la fuerza de arrastre de Stokes y para números de Reynolds pequeños está dada por f = 6πηr, ν es la velocidad de flujo de la suspensión celular. Dado que las células se tratan como objetos esféricos rígidos en un medio de viscosidad η, la velocidad debida a DEP es proporcional al cuadrado del radio de la célula. La trayectoria de la partícula se estima después de calcular las fuerzas en el campo de flujo. El movimiento de las células en un fluido sigue la segunda ley de movimiento de Newton72. La fuerza neta sobre una celda en la etapa DEP se da como:

donde mp es la masa de la celda, \({\text{v}} = d{\text{q}}/dt\) es la velocidad de la celda y q es la posición de la celda, FL, FD, Fdp y Fvm son las fuerzas de sustentación, arrastre, gradiente de presión y masa virtual, respectivamente. El factor CM especifica el signo de la fuerza DEP en función de la frecuencia de trabajo. La figura 2 ilustra el factor CM utilizando un modelo de capa única para los tipos de leucocitos hGBM y IV frente a la frecuencia aplicada. La intensidad de la fuerza dielectroforética sobre las partículas depende del gradiente de permitividad entre la suspensión y las partículas. La etapa DEP consta de un conjunto de electrodos intercalados a lo largo del canal principal para la suspensión celular y dos salidas para CTC y otro es el canal de desechos para leucocitos. Se seleccionan el voltaje y la frecuencia apropiados de modo que cuando el CTC se acerque a los electrodos, experimente una fuerza nDEP, lo que hace que se aleje del área de alto campo eléctrico y finalmente se acerque a la salida. Mientras tanto, los leucocitos sufrirán pDEP y se moverán hacia la otra salida. Como la mayor parte del contenido de sangre (no newtoniano) se eliminó en la primera etapa, se seleccionó solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 × de baja conductividad 0,055 S/m con una permitividad relativa de 78 para la segunda etapa. La velocidad de las partículas se redujo debido a un aumento en el ancho del canal de 50 a 175 µm. Esta reducción de la velocidad permitió que todas las células quedaran expuestas a la fuerza DEP. También disminuyó el campo eléctrico a lo largo de la sección transversal del canal, lo que resultó en la recuperación de células viables, lo que facilitó el aislamiento de las células en las salidas.

La parte real del factor de Claussius-Mossotti (CM) de hGBM y los subtipos de leucocitos se mapea frente a la frecuencia aplicada utilizando un modelo de capa única.

COMSOL Multiphysics v5.5 se utiliza para modelar el dispositivo y se utilizó un módulo de análisis finito para realizar la simulación de dinámica de fluidos computacional (CFD). COMSOL proporciona una interfaz gráfica de usuario (GUI) integrada donde los modelos se pueden construir y resolver mediante el uso de módulos de física predefinidos optimizados para áreas de aplicación específicas. Utilizamos módulos de flujo de fluidos, sistema microelectromecánico (MEMS) y circuitos eléctricos. El objetivo del modelado 2D y 3D era calcular el campo de flujo, validar las fuerzas y visualizar el proceso de separación dentro del dispositivo propuesto. El modelo CAD de geometría se desarrolló utilizando la función de geometría integrada de COMSOL.

El diseño propuesto de la etapa de separación inercial curva-CEA está inspirado en el trabajo de Shamloo et al. El ancho inicial de la región curva es de 50 μm y la longitud es de 1950 μm, mientras que el ancho de la región de expansión es de 350 μm y la longitud de 700 μm. La altura del canal es de 50 μm.

Después del diseño de la geometría, el siguiente paso fue definir el material de dominio del modelo. Aunque COMSOL se complementa con una enorme biblioteca de materiales, para desarrollar un diseño de dispositivo realista que pudiera usarse para pruebas clínicas, los parámetros físicos de la muestra de sangre humana asociados con ambas etapas de separación se extrajeron de la literatura73,76,77,78 y sus valores se encuentran en la Tabla 1. Este estudio se centró en células tumorales cerebrales o células de glioblastoma humano (hGBM) para las cuales no se ha informado una separación previa de DEP en la literatura abierta.

En el generador de modelos COMSOL, las propiedades de simulación de flujo se definieron en el dominio microfluídico. Para evitar una acumulación de células alrededor de un área con esquinas afiladas que ocurría debido a múltiples áreas de velocidad cero, se utilizaron bordes curvos. Como los bordes puntiagudos y las esquinas afiladas no eran óptimos para la eficiencia de separación celular75. Se realizó un mallado cuidadoso para evitar errores como elementos de malla invertida. Se hizo una malla muy fina alrededor de las regiones afiladas y curvas del canal. Para discretizar el dominio computacional de la geometría propuesta, se utilizó una malla estructurada tetraédrica uniforme. Se utilizó una malla estructurada para discretizar la geometría de la etapa inercial. Se realizó un análisis de Independencia de Malla, con 145,046, 177,149 y 669,078 grillas o elementos (Fig. 3). Se obtuvo una convergencia satisfactoria de los resultados con elementos de tamaño entre 1,28 para mallas más finas y 11,9 μm para mallas más gruesas. La tasa de error máxima relacionada con el número dado de elementos fue < 1%.

La distribución de velocidad (componente y) a lo largo de la línea vertical dibujada en el centro de la región expandida muestra la variación de velocidad en la región especificada del canal de microfluidos. El análisis de convergencia de malla se realizó con 145.046, 177.149 y 669.078 elementos o cuadrículas, es decir, (ajustes de malla más gruesos, normales y más finos). El gráfico de líneas indica la convergencia de la malla para el tamaño de cuadrícula de 1,28 µm.

El método de elementos finitos (FEM) se implementó utilizando un módulo de flujo de fluidos. Los resultados obtenidos de la simulación de flujo laminar se utilizaron como entrada para el módulo de rastreo de partículas. Lo que a su vez generó la trayectoria de la partícula en el dominio microfluídico diseñado. Posteriormente, las PDE gobernantes se resolvieron utilizando el software de simulación. La ecuación de Navier-Stokes y las ecuaciones de impulso (convección-difusión no lineal) se resolvieron para la distribución del campo de flujo. Para una relación de aspecto baja, se considera que ap/Dh es < 1, por lo que se eligió un caudal entre 120 y 200 µl/min. Las dos entradas se han definido por velocidades de flujo de 20 y 200 μl/min para una muestra de sangre y flujo de enfoque, respectivamente. Se aplicó una condición de contorno de presión cero en las salidas del canal de microfluidos y se utilizó una condición de contorno sin deslizamiento para las paredes. Se utilizó la formulación de mínimos cuadrados de Galerkin para aproximar las PDE no lineales gobernantes con un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (EDO). Se resolvió el flujo laminar con discretización (P2 + P2) para el flujo de fluido. Da como resultado las fuerzas netas de elevación y arrastre de inercia junto con la masa virtual y la fuerza de gradiente de presión que se utilizarán en el módulo de rastreo de partículas para estimar el movimiento de la celda. Para que la muestra de sangre se inyecte en la entrada, se selecciona un grupo de células que involucra siete líneas celulares: 24 RBC, 12 Plts, 12 WBC (granulocitos, monocitos, linfocitos T, linfocitos B) y 3 CTC. El recuento de células mencionado anteriormente (a escala reducida) se basó en la cantidad real de las mismas células en la sangre humana. Se realizó un estudio dependiente del tiempo con un paso de tiempo de 0,0001 s en el módulo de rastreo de partículas. Las ecuaciones de movimiento se resolvieron considerando la fuerza de arrastre de Stokes con correcciones de pared, la fuerza de sustentación incluyendo la pared inducida y el gradiente de corte, la masa virtual y la fuerza de gradiente de presión.

La geometría principal, utilizada para la comparación de modelos en este estudio, consta de una región curva y una región de expansión. El ancho inicial de la región curva es de 50 μm y la longitud es de 1950 μm, mientras que el ancho de la región de expansión es de 350 μm y la longitud de 700 μm. La altura del canal es de 50 μm. Para la zona de contracción, se selecciona una relación de aspecto (AR = H/W) de 1. Esta cantidad se ha elegido cuidadosamente ya que es fundamental para una separación adecuada. Primero, la simulación se realizó utilizando solo dos partículas modelo de tamaño 4 y 10 µm en la geometría primaria (Fig. 4) y los resultados se compararon con los resultados informados por Shamloo et al.79 elaborados en la Fig. 5. La eficiencia de separación puede determinarse como la relación entre el CTC obtenido en la salida de CTC y la cantidad total de CTC inyectado en la entrada. El modelo simulado describe la posición de la concentración celular máxima con un espacio de separación. Para visualizar la separación celular, las partículas se colorearon según sus tamaños en la Fig. 4.

Resultados de la simulación en la geometría principal con una única arquitectura AR de relación de aspecto baja expandida y curvada contraída. Se inyectaron partículas modelo con tamaños de 4 y 10 µm con el flujo envolvente. La simulación muestra la separación de las partículas con un espacio de separación visible.

Comparación de resultados de simulación de geometría primaria y datos disponibles en la literatura. Se encontró que la brecha de separación promedio entre partículas de 4 y 10 µm y el rendimiento era mayor en la simulación realizada. Sin embargo, la pureza de ambos tamaños de celda fue similar a los datos informados.

La comparación era razonable, pero debido a los diferentes tamaños de celda en estudio y la integración en serie de la etapa DEP, el mismo diseño no funcionó para la separación de hGBM. Por lo tanto, después de establecer el procedimiento de análisis de la etapa de enfoque inercial, se finaliza el diseño personalizado para la separación de RBC y Plt de WBC y CTC mediante la incorporación de cambios geométricos. Se diseñaron y probaron salidas de bifurcación de diferentes tamaños y formas para la separación y recolección de RBC, Plts. , WBC y CTC. El diseño inicial de las salidas se hizo en base al espacio de separación entre las celdas objetivo. efecto centrífugo y ley de bifurcación de Zweifach-Fung80. La Figura 6a–d muestra diferentes diseños de salidas que indican el cambio que ocurrió en la eficiencia y pureza de la separación. El diseño que se muestra en (d) demostró la mejor fuerza de separación mientras validaba los resultados anteriores. Por lo tanto, se seleccionó el diseño de bifurcación (d) para la fase de enfoque inercial, la salida superior es para RBC y Plt rechazados, mientras que la otra se usa para transportar CTC y WBC para una mayor separación. Una vez finalizado el diseño, se realizaron varias simulaciones para determinar la eficiencia y la pureza de la separación, es decir, la relación entre el número de células recolectadas en la salida deseada y el número total de células en esa salida, en diferentes relaciones de aspecto.

Las diferentes salidas diseñadas destacan la selección de la fase de enfoque inercial. Para visualizar la eficiencia de separación, las partículas se colorean según su tamaño. (a) Las salidas se diseñan en función de la brecha de concentración de partículas en el modelo inicial. (b) Tamaños de salida alterados (c) Tamaño de salida de residuos aumentado (d) La bifurcación simétrica de las salidas da como resultado la separación efectiva de CTC del resto de las células sanguíneas.

Observamos que las células comienzan a enfocarse a medida que la fuerza de inercia domina sobre la fuerza de arrastre decano alrededor de ap /Dh ~ 0.1. A partir de esto, podemos predecir que la separación de CTC de otras células sanguíneas se puede realizar en la geometría CEA curva diseñada por debajo de 70 μm de altura con el número de Reynolds Re por encima de 18.

Para la simulación de la etapa de separación DEP se utilizaron módulos de corriente eléctrica, flujo de fluidos y rastreo de partículas. El modelo consta de estado estacionario estacionario, dominio de frecuencia y estudio transitorio. La velocidad, la presión y los campos de distribución de potencial eléctrico de CA se calcularon utilizando un estudio estacionario, mientras que el estudio transitorio se utilizó para generar trayectorias de partículas influenciadas por la fuerza DEP. Para la física de corrientes eléctricas, se seleccionó la condición de contorno de aislamiento eléctrico para las paredes del microcanal. Definir el potencial eléctrico en los electrodos anularía los lugares de los electrodos dentro de las paredes. Se utilizaron electrodos de forma cuadrada con lados de 80 μm, que son factibles para la fabricación. Para generar un campo eléctrico se utilizaron electrodos con el mismo voltaje y signos alternos. Se aplicó a los electrodos un potencial eléctrico que oscilaba entre 3,5 y 5 V. Para calcular el campo eléctrico, se ha optado por la malla fina, mientras que la malla gruesa se generó para resolver el campo de flujo de fluidos. Se usaron diferentes mallas cerca de las esquinas afiladas para refinar la solución. Para el estudio estacionario del flujo de fluidos, se utilizó un solucionador algebraico multirrejilla (AMG) o preacondicionador como solucionador lineal, el campo eléctrico se calculó utilizando el solucionador iterativo BiCGStab y el solucionador iterativo GMRES con el método Jacobi se utilizó para el seguimiento de celdas. En el caso del rastreo de partículas, la condición límite para las paredes del canal de la etapa DEP se estableció en "rebote" y la condición de las salidas se estableció en "pegarse", lo que significa que las células rebotarían o se pegarían a las salidas en caso de colisión, respectivamente. Las células separadas (CTC y WBC) de la salida de la primera etapa entran en el dominio de la segunda etapa. Dado que la mayor parte del volumen se rechaza junto con los glóbulos rojos y las plaquetas en la etapa de inercia, se necesitaba más tampón (0,1xPBS) para el flujo de enfoque. La suspensión fluida era un flujo newtoniano sobre todo en esta etapa, por lo tanto, tenía una conductividad eléctrica baja ~ 0,055 S/m. Tal configuración genera fuerza tanto pDEP como nDEP para acercar o alejar las células de los electrodos, respectivamente. Desde el recorrido de los leucocitos y CTC, los primeros se observaron cerca de los electrodos. Por lo tanto, se puede concluir que la fuerza pDEP se impone sobre los glóbulos blancos mientras que los CTC experimentan la fuerza nDEP.

En este artículo, inicialmente se simuló numéricamente un canal microfluídico inercial basado en el estudio de Shamloo et al. El diseño del dispositivo se modificó de acuerdo con la muestra deseada, es decir, sangre total después de verificar la geometría básica a la luz de los resultados de la investigación de Shamloo et al.79 Las partículas que se examinaron fueron de 12,2, 6,58, 9,26, 9,42, 4 y 2 µm. de diámetro que representan CTC, WBC (cuatro tipos principales), RBC y plaquetas, respectivamente. Para encontrar los parámetros de diseño óptimos, se estudió la relación entre la relación de aspecto del canal, el caudal y la eficiencia de separación. Posteriormente, la etapa DEP se diseñó por separado y luego se integró en serie con el microcanal inercial para facilitar y mejorar el aislamiento de CTC de la muestra de sangre total.

El modelo propuesto aprovecha las geometrías de separación curvas y de matriz de contracción-expansión (CEA). Se introducen fuerzas de inercia adicionales cuando el microcanal se curva o cambia su relación de aspecto (por ejemplo, geometrías curvilíneas y CEA, respectivamente). Dichos cambios geométricos inducen un flujo Dean secundario transversal en el microcanal. La arquitectura combinada ha sido diseñada para fortalecer los vórtices de flujo Dean al nivel de separación en una longitud distintiva más corta en comparación con las geometrías CEA rectas. Inicialmente, solo se consideraron cuatro líneas celulares, es decir, RBC, Plt, WBC y hGBM. Dos vórtices decanos generados dentro del canal (Fig. 7) se refuerzan entre sí, lo que da como resultado la máxima magnitud de velocidad para obtener la máxima eficiencia de separación y pureza para los CTC.

El vórtice de flujo secundario o los vórtices de flujo de Dean aparecen en el canal curvo y cambian su fuerza a lo largo del ancho para lograr la máxima magnitud de velocidad. Las flechas muestran la fuerza de arrastre de Dean. El equilibrio entre las fuerzas de arrastre y sustentación inercial determina la dirección final de la partícula a través del canal dependiendo del tamaño de la partícula. Las partículas más pequeñas siguen la línea de flujo y se mueven hacia la salida superior, mientras que las partículas más grandes se mueven hacia la salida inferior.

La mayor parte de la literatura disponible considera el diámetro medio de los leucocitos y descuida las variantes reales de leucocitos o leucocitos. Esto añade un error inherente o una limitación en los resultados. Teniendo en cuenta las condiciones prácticas, agregamos subtipos de glóbulos blancos en nuestro modelo, es decir, monocitos, linfocitos T, linfocitos B y granulocitos. Se han aprovechado las propiedades mecánicas y dieléctricas para separar los glóbulos blancos (granulocitos y monocitos) de los CTC. Nuestro análisis muestra que solo las CTC se concentran hacia el lado derecho del canal, Fig. 8, mientras que otras células se acumulan a la izquierda. Como se discutió anteriormente, las celdas grandes, es decir, los CTC, están influenciadas por la fuerza de sustentación inercial, que las retiene en una posición casi constante con respecto a la pared del canal. Por el contrario, el flujo Dean creado en la región curva lleva al resto de las células más pequeñas a concentrarse hacia la salida n.° 2 de la etapa 1. La Figura 8 muestra las trayectorias de las células desde el módulo de rastreo de partículas, curiosamente los linfocitos T y B ( 6,58 μm) se separaron junto con los glóbulos rojos y las plaquetas, mientras que los granulocitos y los monocitos son comparables en tamaño con las CTC y se administraron a la etapa DEP junto con las CTC. Se observó que los leucocitos que tienen tamaños cercanos a Plts y RBC (2-6 µm) se drenan junto con ellos. Mientras que ciertos tipos de leucocitos que tienen diámetros cercanos a CTC (9–12,2 µm) se llevan bien entre sí, abriéndose camino hacia la segunda etapa del dispositivo de microfluidos. Estos resultados han validado nuestra hipótesis de que la geometría combinada con curvas y CEA podría obtener los resultados requeridos con longitudes más pequeñas.

Resultados del rastreo de partículas de una muestra de sangre completa considerando subtipos de leucocitos. La leyenda de colores muestra los tamaños de las partículas que se inyectan. En la región de expansión, tiene lugar la separación de partículas pequeñas, es decir, RBC y plaquetas, de las partículas más grandes, es decir, CTC y WBC, y continúan moviéndose hacia sus respectivas salidas. Sin embargo, se ha observado que ciertos subtipos de glóbulos blancos se abrieron paso junto con los glóbulos rojos y las plta hacia la salida de desechos para el rechazo inicial de glóbulos rojos y plta.

Para evaluar el rendimiento de la etapa de inercia propuesta, calculamos la eficiencia de separación y la pureza de la suspensión celular en diferentes relaciones de aspecto que van desde 0,8 a 2. En general, se observó que la eficiencia de separación es pobre cuando la relación de aspecto es < 1. Con una relación de aspecto de 1, la eficiencia de separación de la primera etapa aumenta al 100% (Fig. 9). Entre la relación de aspecto 1 y 2, ciertos tipos de glóbulos blancos cuyos tamaños son comparables a los de los glóbulos rojos también migraron a la salida n.º 1. En general, se obtiene una eficiencia de separación de glóbulos rojos y plaquetas del 100 % para una relación de aspecto ≥ 1. El umbral de la relación ap/Dh se observa como ~ 0,1 para la máxima eficiencia de separación según lo informado por81.

Eficiencia de separación versus relación de aspecto de glóbulos rojos y plaquetas. El AR bajo de la geometría combinada propuesta se consideró adecuado para una máxima eficiencia de separación.

La distribución del campo de velocidad del dispositivo microfluídico de dos etapas se muestra en la Fig. 10. El gráfico de superficie muestra una disminución en la velocidad a medida que el fluido se transfirió a la región de expansión y luego a los canales aguas abajo bifurcados simétricos. Esto sucede debido a la resistencia hidráulica, que se relaciona directamente con la presión dinámica del fluido. La magnitud de la velocidad cambia debido al cambio en la fuerza del vórtice de flujo secundario y debido a los cambios geométricos a través del canal. La velocidad de las partículas se redujo debido a un aumento en el ancho del canal de 50 a 175 μm. Esta reducción en la velocidad posteriormente ralentizó las células y les permitió quedar expuestas a la fuerza DEP. También disminuyó el campo eléctrico dentro del canal, lo que resultó en la recuperación de células viables, lo que facilitó el aislamiento de las células en las salidas.

Distribución del campo de velocidades del dispositivo híbrido propuesto. El gráfico de superficie de la velocidad indica el campo de velocidad dentro del dispositivo propuesto en el espectro de color. Cuando se inyecta el búfer de enfoque, la velocidad alrededor de su entrada es alta (representada por la región roja). La suspensión celular se inyectó a baja velocidad, lo que redujo la velocidad de la corriente de fluido en la región contraída curva (representada por la región verde). A medida que el fluido entra en la región expandida, reduce aún más la velocidad (representada por la región azul). Al final de la etapa de inercia, el canal único se bifurca, dividiéndose y luego reduciendo el flujo volumétrico. El tamaño del canal de la etapa DEP se incrementa aún más. Esta ecualización de la resistencia hidráulica promueve la distribución uniforme del flujo en la etapa DEP, donde se obtiene un espectro azul uniforme con la simulación de flujo de fluido.

La Figura 1 muestra el diseño propuesto de la etapa DEP, para garantizar la separación continua de celdas con el flujo de fluido, la presión dinámica y la velocidad generada dentro del canal diseñado. Para la continuidad efectiva del flujo, se examinó la presión dinámica del fluido del canal microfluídico. La etapa DEP se rige por parámetros que incluyen el voltaje aplicado, la frecuencia y la cantidad de electrodos. El factor CM de leucocitos y hGBM se calcula frente a la frecuencia aplicada en la Fig. 2. Las frecuencias de cruce de leucocitos, es decir, monocitos, granulocitos, linfocitos T y linfocitos B, oscilan entre 220 y 330 kHz. Sin embargo, la frecuencia de cruce de hGBM es de alrededor de 511 kHz. Por lo tanto, para aislar las CTC de los leucocitos, puede usarse una frecuencia que oscile entre 331 y 500 kHz para inducir pDEP a los leucocitos y nDEP a la hGBM.

Investigamos bajo pDEP qué tan significativa es la diferencia de comportamiento entre todas las variantes de leucocitos al fijar la frecuencia aplicada primero a 350 kHz. El voltaje se puede variar en un amplio rango. Dado que las celdas son vulnerables a un campo eléctrico alto, son más deseables voltajes de trabajo bajos. Por lo tanto, examinamos el proceso de separación celular utilizando frecuencias que oscilan entre 350 y 400 kHz y voltajes entre 2 y 5 V. Se observa que para separar los leucocitos de las CTC, para una combinación dada de voltaje y frecuencia, se requiere un número definido de electrodos. . El uso de nueve electrodos garantizó una separación suficiente a una frecuencia de 370 kHz. La Fig. 11 ilustra las trayectorias finales de las partículas que muestran una separación del 99,5 % de las CTC de los leucocitos o los WBC. Video 1. Un tipo muy similar de hallazgos sobre el cáncer de mama ha sido informado por luna y colegas; en la misma dirección, el cáncer colorrectal y la lucemia también se informaron anteriormente y respaldan nuestros hallazgos actuales por 39,82,83,84.

Resultado del rastreo de partículas. Separación exitosa de CTC de leucocitos en la etapa DEP. La suspensión celular con distribución aleatoria de leucocitos y CTC provenientes de la etapa inercial ingresa a la entrada de la etapa DEP. Las líneas de color son trayectorias celulares, el azul y sus sombras representan leucocitos mientras que las CTC están representadas por el color rojo.

Este estudio demuestra el diseño y la simulación de un dispositivo de clasificación de microfluidos de dos etapas altamente específico, continuo y sin etiquetas basado en enfoque inercial y DEP para aislar CTC (hGBM) de sangre total. El presente trabajo tiene como objetivo resolver las limitaciones del método DEP mediante la adición de una etapa de separación basada en el tamaño de enriquecimiento previo. En la etapa de preenriquecimiento, las células pequeñas (típicamente glóbulos rojos y plásmidos) constituyen la mayor parte del volumen sanguíneo, es decir, se separa el 45 %. Estas células son responsables de la conductividad sanguínea y de la naturaleza no newtoniana. Separarlos en la fase inicial aumenta la pureza y la eficiencia del aislamiento de los CTC. Los leucocitos y CTC restantes con tamaños comparables (9,26–12,2 µm) se transportaron a la etapa DEP donde se lleva a cabo la separación en función de las propiedades eléctricas de las células antes mencionadas. Los CTC resultantes son viables y se pueden utilizar más para el diagnóstico y para diseñar una terapia específica para el paciente, lo que hace que la metodología propuesta sea más útil. Los resultados muestran un nivel de pureza del 99,5 % con un alto rendimiento de 12,2 ml/h. Para mejorar la eficiencia de la separación, se realizaron varias simulaciones computacionales para verificar nuestro diseño e integración propuestos. Esta simulación de dispositivo integrado demostró la clasificación eficiente de las células utilizando nuestro dispositivo DEP inercial de dos etapas. En la primera etapa, se separaron los glóbulos rojos y las plaquetas pequeños de las muestras de sangre utilizando la técnica de enfoque inercial. Las células grandes como las CTC y los leucocitos se separaron entre sí usando la fuerza DEP. La mayoría de los investigadores utilizaron muestras enriquecidas o binarias para las pruebas, lo que implica una limitación inherente para las prácticas clínicas. Hemos utilizado una muestra de sangre entera junto con PBS con una relación de dilución admisible de 1:10. Hemos utilizado hGBM como CTC en nuestra investigación para la cual no se ha informado ninguna separación de DEP según nuestro leal saber y entender. Sin embargo, el dispositivo propuesto se puede usar para aislar otros tipos de células tumorales (siempre que tengan un tamaño comparable al de los leucocitos) cambiando los parámetros de diseño de la etapa DEP, es decir, la frecuencia y el voltaje aplicados.

El diseño del dispositivo propuesto tenía un concepto para superar el problema de la pérdida celular, la fragmentación celular, la citotoxicidad y la deformación celular que ocurrían durante la preparación de muestras para la mayoría de los tipos de métodos de separación celular. El estudio utilizó el método de separación por flujo inercial en lugar de la centrifugación. Por lo general, la centrifugación se realiza como un requisito previo para la preparación de muestras de pruebas clínicas o de laboratorio, lo que causa los problemas mencionados anteriormente. Como los leucocitos y la mayoría de las CTC tienen un tamaño similar, el método inercial no es muy popular para la clasificación de CTC debido a la contaminación de WBC o leucocitos. El presente estudio utilizó un método DEP sin etiquetas que clasifica diferentes tipos de células según su movimiento en respuesta al campo DEP. Esto se debe a las diferencias de frecuencia de cruce de celdas en virtud de sus propiedades dieléctricas únicas. El estudio emplea un método de dos etapas, lo que reduce la población de células, también el bajo voltaje y la frecuencia reducen la posibilidad de calentamiento por julios y lisis celular. Aunque este método tiene una alta eficiencia de aislamiento, adolece de un bajo volumen de procesamiento, posibilidad de obstrucción de la celda debido a la sobrecarga y calentamiento por joule debido a los voltajes aplicados. El volumen de procesamiento limitado general se debe a la integración en serie. El diseño de nuestro dispositivo ofrece una eficiencia general de aislamiento o recuperación celular de hasta el 99,5 %. En general, nuestro estudio de simulación actual tiene el potencial para un dispositivo altamente eficiente, sin embargo, las variaciones genéticas en la muestra, la variación debido a la raza y la presencia de otras enfermedades, así como las terapias medicinales que pueden afectar la consistencia, la viscosidad, la toxicidad celular, etc. de la muestra.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82170481), la Fundación de Ciencias Naturales de Anhui (2008085J39 y 2108085MH314), el Comité Educativo de la Fundación de Ciencias Naturales de Anhui (KJ2020A0728), el Laboratorio Estatal Clave de Química e Ingeniería Molecular de Recursos Medicinales (Guangxi Normal University) (CMEMR2021-B03), Excelente programa de capacitación de talentos de primer nivel de las universidades de Anhui (gxbjZD2022073), Disciplinas clave de farmacia (2019xjzdxk2) y Centro de investigación de ingeniería de medicina natural y alimentos funcionales de Suzhou (SZ2017ZX06).

Departamento de Ingeniería Mecatrónica y de Control, Universidad de Ingeniería y Tecnología, Lahore, Pakistán

Maliha Saleem Bakhshi y Mohsin Rizwan

Departamento de Farmacología y Terapéutica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Punjab Central, Lahore, Pakistán

Ghulam Jilany Khan

Escuela de Ingeniería Biológica y Alimentaria, Centro de Investigación de Ingeniería para el Desarrollo y la Utilización de Alto Valor de Materiales Medicinales Genuinos en la Provincia del Norte de Anhui, Universidad de Suzhou, Suzhou, Anhui, 234000, China

Hong Duan y Kefeng Zhai

Laboratorio clave de química e ingeniería molecular de recursos medicinales (Universidad Normal de Guangxi), Guilin, 541004, República Popular de China

Kefeng Zhai

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BMS concibió la idea, realizó el estudio y escribió el manuscrito y KGJ conceptualizó la idea, organizó los estudios y escribió el texto principal del manuscrito y DH preparó las figuras 4, 5, 6, 7, 8 y 9 para mayor claridad de comprensión. RM supervisó los estudios y revisó el manuscrito y ZKF revisó el manuscrito y es el autor correspondiente.

Correspondencia a Mohsin Rizwan, Hong Duan o Kefeng Zhai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Bakhshi, MS, Rizwan, M., Khan, GJ et al. Diseño de un novedoso chip microfluídico integrado para la separación continua de células tumorales circulantes de células de sangre periférica. Informe científico 12, 17016 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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Recibido: 09 mayo 2022

Aceptado: 20 de septiembre de 2022

Publicado: 11 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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